鐵錳氧化菌對水稻幼苗根系鐵錳膜形成的影響及效果

陳金媛，范芳娟，靳夢楠，李 丁

（湖南工業大學生命科學與化學學院，湖南 株洲 412007）

當前，工農業技術越來越先進，但技術發展的同時也帶來了許多負面影響。例如，越來越多的土壤受到重金屬等的污染，尤其是水稻農田的重金屬污染問題引起了民眾的廣泛關注。水稻是我國大部分地區的主要糧食作物，土壤中的重金屬通過水稻制品進入食物鏈，導致Cd、As 等重金屬大量在人體中積累，對人體健康造成極大危害。研究表明，人體Cd 中毒將導致骨質疏松癥、癌癥[1]，As 中毒會誘導神經系統并發癥、癌癥[2-3]等。因此，探究重金屬污染的水稻農田修復以及安全利用具有重要的現實意義。

鐵錳膜（iron manganese plaque，IP）是附著在濕地植物根系表面的一層鐵錳氧化膠膜，具有阻隔植物吸收污染物的作用[4]。生長在淹水環境中的濕地植物向根際運輸并釋放氧氣，維持植物的正常呼吸，同時，多余的氧氣可將環境中的Fe2+和Mn2+氧化并沉淀為包裹根面的鐵錳斑，最終形成鐵錳膜[5]。由于具有吸附功能的基團，鐵錳膜可以吸附或共沉淀金屬離子，并作為“屏障”減少植物對Pb、Cu、Ni、Hg 和Sb等金屬的吸收[6-7]，還可以改變植物體內As、Cd 和Se 的轉運[8]。還有研究表明，因為對金屬離子具有較強的吸附性，鐵錳膜可用作緩沖劑，降低As 在水中的溶解度[9]。

鐵錳膜的形成受土壤理化性質、水分管理、根際氧化物質以及鐵錳氧化菌和鐵錳還原菌等[10-11]多種因素的影響。其中，鐵錳氧化菌是一類能夠促進鐵、錳氧化形成鐵、錳氧化物的微生物。已有研究表明，鐵錳氧化菌能夠促進植物根系鐵錳膜的形成。Providenciasp. LLDRA6 是一株分離自湖南省株洲市清水塘某冶煉廠周邊土壤的細菌，前期已通過基礎試驗證明菌株具有錳氧化能力和鐵氧化能力[12]。筆者擬通過水培試驗初步探究該菌株對鐵錳膜形成以及Cd 在水稻植株體中轉運的影響，為該菌株的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 種供試菌株為土壤細菌Providenciasp.LLDRA6（CCTCC 保藏編號：M2018876），分離自湖南省株洲市清水塘某冶煉廠周邊的土壤，前期已通過基礎試驗證明菌株LLDRA6 具有錳氧化能力和鐵氧化能力。

1.1.2 培養基（1）LB 培養基：酵母浸粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，超純水1 000 mL，pH值 7.0（固體培養基加18.0 g 瓊脂）。（2）水稻營養液組分：NH4NO391.4 mg/L、NaH2PO4·2H2O 32.14 mg/L、K2SO471.4 mg/L、CaCl288.6 mg/L、MgSO4158.22 mg/L、MnCl2·4H2O 1.5 mg/L、(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.074 mg/L、H3BO30.934 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.035 mg/L、CuSO4·5H2O 0.031 mg/L、FeCl34.62 mg/L、Citric acid monohydrate 11.9 mg/L。

1.1.3 供試水稻供試水稻品種為華占和臺北309，水稻種子來自湖南雜交水稻研究中心。種子消毒后催芽，選取長勢均勻的幼苗移栽。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配置（1）菌株懸浮液：將供試菌株接種至LB 液體培養基中于35℃的恒溫搖床中180 r/min 培養16 h 后，6 000 r/min 離心10～15 min 收集菌體，并重懸于同等體積無菌去離子水中制成懸浮液備用。（2）DCB 提取液：稱取88.23 g Na3C6H5O7·2H2O 和10.48 g NaHCO3，去離子水充分溶解后，定容至1 L 容量瓶中，Na3C6H5O7·2H2O濃度為0.3 mol/L，NaHCO3濃度為0.125 mol/L。

1.2.2 試驗設計水稻發芽后，選取長勢均勻的水稻幼苗，分栽至黑色避光水稻盆中（每盆1 L 營養液）。試驗設置5 個處理，每個處理3 個平行，分別為：處理1（CK），空白對照；處理2，菌株懸浮液+Fe2+（Fe2+濃度為5 mmol/L，菌株懸浮液添加量為30%）；處理3，H2O+Fe2+（Fe2+濃度為5 mmol/L）；處理4，菌株懸浮液+Mn2+（Mn2+濃度為1 mmol/L，菌株懸浮液添加量為30%）；處理5：H2O+Mn2+（Mn2+濃度為1 mmol/L）。每星期換2 次營養液，生長1 周后檢測根系DCB-Fe和DCB-Mn 含量；然后在營養液中添加Cd2+（Cd2+濃度1 mg/L），繼續生長1 周后，收集莖葉部分樣品進行檢測。

1.2.3 DCB 法檢測根系鐵錳膜含量水稻根系表面鐵錳膜含量的檢測方法為DCB（dithionite-citratebicarbonate）提取法。隨機選取不同盆栽水稻根系，洗凈后自然晾干水分，置于盛有30 mL DCB 提取液和0.5 g 保險粉的錐形瓶中，室溫下浸提1 h。浸提液過0.25 μL 針孔式水系濾膜，濾液于4℃冰箱保存，Fe、Mn含量采用原子火焰吸收儀測定。

1.2.4 酶活性的檢測方法與步驟：按所用試劑盒（POD、SOD）說明書進行操作。具體內容如下：將收集的新鮮水稻根系組織剪碎，稱量約0.1 g 放入玻璃勻漿器中，加入提取液1 mL，冰浴中進行勻漿；待樣本完全研碎后，將勻漿轉移至1.5 mL 離心管；4℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書進行后續操作，計算不同處理下水稻根系POD和SOD 酶活性。

1.2.5 莖葉部分鎘含量將所有水培水稻莖葉部位的樣品分別裝入紙袋，65℃下干燥72 h，烘干至恒重后研磨成粉，送湖南雜交水稻研究中心檢測樣品中的Cd 含量。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2003、Origin 8.5.0等進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對水培水稻根系外觀的影響

水稻種子消毒浸泡發芽，選取長勢均勻的水稻幼苗，分栽至黑色避光水稻盆中適應生長，1 周后進行處理。處理后又生長了1 周的水稻根系如圖1 所示。經懸浮液+Fe2+處理后，2 個水稻品種的根系均呈現明顯的紅色，且顏色比H2O+Fe2+處理組更深。由此推測，LLDRA6 菌株可能會促進水稻根系表面形成較厚的鐵錳膜。

圖1 不同處理下水培水稻根系的外觀

2.2 不同處理對水稻根系POD 和SOD 酶活性的影響

由圖2 可知，臺北309 品種的根系POD 酶活性顯著高于華占的；2 個水稻品種處理2～5 的POD 酶活性高于處理1（CK）。華占品種中，處理2（懸浮液+Fe2+）和處理4（懸浮液+Mn2+）的POD 酶活性略高于其他處理組；臺北309 品種中，處理3（H2O+Fe2+）和處理4（懸浮液+Mn2+）的POD 酶活性顯著高于其他處理組。華占與臺北309的SOD酶活性無明顯差異，處理后的水稻根系SOD 酶活性顯著高于CK，且2 個品種均以處理3（H2O+Fe2+）的SOD 酶活性最高。總體來看，菌株懸浮液和Fe2+、Mn2+溶液處理，可以增高水稻根系的POD 酶和SOD 酶活性。由于SOD 酶可以清除植株的自由基，而POD 酶在植物的抗逆性中起重要作用。因此，上述溶液處理可以增強水稻的抗逆及防御系統，提高水稻對環境的適應性。

圖2 不同處理下2 個品種水稻根系的POD 和SOD 酶活性

2.3 不同處理對水稻根系鐵錳膜含量的影響

由表1 可知，華占品種中，處理2 的DCB-Fe 含量最高，處理4 的DCB-Mn 和DCB-Cd 含量最高。臺北309 品種中，處理2～5 的DCB-Fe 含量均高于處理1（CK），其中處理2 的DCB-Fe 含量最高；處理5 的DCB-Mn 含量高于其他處理，處理4 次之；處理2 的DCB-Cd 含量高于其他處理。產生這樣結果的原因可能是鐵錳氧化菌LLDRA6 促進了Fe2+、Mn2+氧化形成致密的鐵錳膜附著在根表面，而鐵錳膜上又吸附了大量的Cd 元素阻止Cd 元素繼續向水稻莖葉部分運輸。

表1 不同處理下2 個品種水稻根系表面的元素含量

2.4 不同處理對水稻莖葉部分鎘含量的影響

如圖3 所示，2 個水稻品種處理2～5 的莖葉部分Cd 含量均顯著低于處理1（CK）。其中，華占品種中，處理2 的Cd 含量最低，其次是處理3，二者的Cd 含量均遠低于處理4～5；而臺北309 品種中，處理3 的鎘含量最低，其次是處理2，二者的Cd 含量均遠低于處理4～5。由此推測，菌株LLDRA6 和Fe2+溶液誘導鐵錳膜形成的效果強于LLDRA6 和Mn2+溶液。然而，鐵錳膜的形成受諸多因素的影響，不同水稻品種間存在差異。

圖3 不同處理下2 個品種水稻莖葉部分的Cd 含量

3 結論與討論

在盆栽水培條件下，用鐵錳氧化菌菌懸液和Fe2+、Mn2+溶液處理水稻幼苗，1 周后，菌株懸浮液+Fe2+處理的2 個水稻品種的根系均呈現明顯的紅色，說明菌株LLDRA6 懸浮液可促進水稻根系表面形成鐵膜；DCB 法結果也證實了這一點，菌株懸浮液+Fe2+處理的水稻根系表面DCB-Fe 含量顯著高于其他處理；根系酶活檢測結果顯示，經Fe2+和Mn2+處理后，水稻根系的POD 酶和SOD 酶的活性高于空白對照組；經Fe2+處理后，2 個水稻品種莖葉部分的Cd 含量顯著低于其他處理組。由此推測，菌株LLDRA6 可促進水稻根系表面鐵錳膜的形成，對Cd 在水稻植株中的遷移具有顯著的阻隔效果。

大米一直被認為是人體Cd 攝入的主要途徑之一[13]。水稻根系表面鐵錳膜的形成主要受土壤氧化以及還原體系中Fe、Mn 在水稻根表的還原溶解和氧化成礦情況影響。錳在金屬從水稻土到植株根部的運輸中起著至關重要的作用[14]。然而，鐵錳膜的形成是一個動態的過程，在不同環境以及不同植物及其生長不同時期均有明顯的差異。此外，水稻對Cd 的吸收還受土壤中Cd 的有效性以及根際環境的影響。其中，Cd 的有效性主要由Cd2+的形態決定。而根際環境主要受根系生長的物理力、根系分泌物以及根際微生物的影響[15-16]。這可能是導致根際土壤中Cd 的流動性、生物有效性和歸趨獨特性的主要原因[17]。

目前，關于鐵錳膜對水稻吸收污染物影響的研究已有較多報道。例如，有研究稱，IP 對水生植物吸收和攝取抗生素的影響主要表現在其可以阻止抗生素在植物體內的吸收和轉運。Tang 等[18]的研究表明，四環素類藥物（TCs）在根面的吸附量與IP 量呈正相關，TCs 的轉運因子也與IP 含量呈良好的負線性關系。當多環芳烴和多溴聯苯醚在淹水狀態下暴露于2 種紅樹植物的根部時，根部形成的IP 起到了“屏障”的作用，阻止了污染物進入植物[19]。還有研究顯示，具有發達根系且能夠形成鐵錳膜的水生植物常用于修復受污染的水體。

筆者的研究證明了菌株LLDRA6 能夠促進水稻根際表面鐵錳膜的形成，鐵錳膜又可以有效阻隔水稻對Cd 元素的吸收和轉運，同時可以通過增強POD 和SOD 酶活性來提高水稻的抗逆性。然而，該研究是基于溶液水平完成的，植株根系所處環境與真實的水稻生長環境有較大差異。因此，后續將開展土壤盆栽試驗以及大田試驗進行進一步驗證。