大鰭鳠GHR 基因CDS 區克隆及生物信息學分析

葛玲瑞，劉科均，張建國

（湖南生物機電職業技術學院，湖南 長沙 410127）

生長激素（growth hormone，GH）是動物腦垂體分泌的、具有促進機體生長和蛋白合成等作用的單鏈多肽。GH 與生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）結合，可以啟動信號傳導促進胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ）的表達，而IGF-Ⅰ通過血液循環運往各個組織，開啟促進動物體生長的功能[1]。GH 效應的發揮主要受組織中GHR 數量及功效的影響[2]。目前已有數10 種魚類的GHR基因被克隆，包括金魚（Carassius auratus）[3]、黃顙魚[4]、河川沙塘鱧[5]、建鯉[6]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[7]、南方鲇（Silurus meridionalis）[8]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[9]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[10]、黃鰭鯛（Sparus latus）[11]等。

大鰭鳠（Hemibagrus macropterus）屬鲇形目鲿科鳠屬，其肉質細嫩、骨刺少，為優質食用魚，具有較高的經濟價值。目前對大鰭鳠的研究主要集中在繁殖生物學[12]、遺傳多樣性[13]及其免疫[14-15]等方面，而關于大鰭鳠生長、抗逆等方面的研究報道還相對較少，尤其是關于大鰭鳠GHR基因和GHR基因的生物信息學分析的研究尚未見報道。基于此，筆者利用cDNA 末端快速擴增（RACE）的方法成功獲取了大鰭鳠GHR基因的CDS 區序列，并對大鰭鳠GHR基因CDS 區進行了生物信息學分析，為今后大鰭鳠生長調控機制和GHR基因及相關信號通路的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用大鰭鳠樣品取自沅陵輝佳水產養殖合作社養殖基地，體重為（5.34±1.22）g，體長為（6.13±0.42）cm。樣品經解剖后取全腦和肝臟組織，投入液氮中速凍后于-80℃冰箱中保存備用。

其他試驗材料包括SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒[寶日醫生物技術（北京）有限公司]，TRIzol Reagent、The ReverTra Aceαfirst-strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成從大鰭鳠轉錄組中獲得GHR基因的部分序列，設計克隆大鰭鳠GHR基因的開放閱讀框（ORF）序列，利用Prime Explorer 軟件設計引物（表1）。

表1 大鰭鳠GHR 基因的克隆所用引物

1.2.2 總RNA 提取及cDNA合成取大鰭鳠全腦組織，按照TRIzol法提取總RNA，檢測RNA質量和濃度。參照反轉錄試劑盒說明書，將RNA 反轉錄為cDNA，然后存放于-80℃冰箱保存。

1.2.3 PCR 擴增及克隆測序以大鰭鳠全腦的總RNA 為模板，根據反轉錄試劑盒的操作步驟，反轉錄出全腦的cDNA。通過RACE 技術，克隆出5'和3'端部分序列并送擎科生物科技有限公司進行測序，利用DNAMAN 軟件對測序結果進行拼接，獲得大鰭鳠GHR基因cDNA 序列。

1.2.4 生物信息學分析利用NCBI 中OFR Finder 程序對大鰭鳠GHR基因核苷酸序列進行開放閱讀框分析；利用NCBI 獲取不同物種GHR基因的核苷酸序列，使用DNAStar 7.0 軟件中的MegAlign 模塊進行相似性分析并構建系統進化樹；利用ProtParam 分析大鰭鳠GHR 蛋白質的理化性質；使用SignalP 4.1 Server預測信號肽；利用TMHMM 預測跨膜結構域；使用NetPhos 3.1 Server 預測磷酸化位點；使用NetNGlyc 1.0 Server 預測N-糖基化位點；使用YinOYang 1.2 Server預測O-糖基化位點；使用Cell-Ploc 2.0 進行蛋白亞細胞定位；利用SPOMA 和Phyre2 分析蛋白質的二、三級結構；利用SMART 預測蛋白質的功能結構域和蛋白互作關系。具體網址如表2 所示。

表2 生物信息學分析軟件

2 結果與分析

2.1 大鰭鳠GHR 基因核苷酸序列及氨基酸序列分析

利用NCBI 中的ORF Finder 對測序得到的大鰭鳠GHR 基因核苷酸序列進行了開放閱讀框分析，發現其ORF 區長1 731 bp，共計編碼576 個氨基酸（圖1）。通過DNAMAN 對序列進行分析，發現其核苷酸序列A、T、C、G 含量分別為25.1%、26.7%、24.4%、23.8%。

圖1 大鰭鳠GHR 基因開放閱讀框序列及推導的氨基酸序列

2.2 GHR 基因相似性分析和系統進化樹構建

將克隆所得大鰭鳠GHR基因CDS 區序列與其他物種進行相似性比對，結果（圖2）顯示，大鰭鳠GHR基因CDS 區序列與黃顙魚、斑點叉尾鮰、鯉魚、斑馬魚、牛、人、小鼠、雞和林蛙的相似性分別為90.3%、88.7%、66.9%、65.7%、44.2%、46.2%、46.2%、48.2%和45.8%；其中，大鰭鳠GHR基因核苷酸序列與黃顙魚的相似性最高，與林蛙的相似性最低。進一步構建系統進化樹（圖3）發現，大鰭鳠、黃顙魚等魚類與哺乳動物進化關系較遠。

圖2 大鰭鳠GHR 基因不同物種間相似性分析

圖3 大鰭鳠GHR 基因系統進化樹

2.3 生物信息學分析結果

2.3.1 大鰭鳠GHR 蛋白的理化特性、跨膜區和信號肽預測使用ProtParam 程序對大鰭鳠GHR 蛋白理化特性、跨膜區和信號肽進行預測分析，大鰭鳠GHR 蛋白分子式為C2900H4483N765O888S28，分子量為65 170.77，理論等電點為4.94，是一種堿性蛋白。該蛋白的不穩定指數為55.81，為不穩定蛋白；半衰期為30 h，脂肪系數為83.16，總平均親水性為-0.368，為親水性蛋白。信號肽預測結果顯示，該蛋白區分剪切位點的C 值為0.704，區分信號肽位置區域的S 值為0.939，Y 值為0.758，大于設定閾值（0.5），表明該蛋白有信號肽結構，屬于分泌蛋白，信號肽剪切氨基酸位點在第22 和23 位之間（圖4）。該蛋白有1 個跨膜結構域，位于氨基酸序列的第254～273 位，屬于跨膜蛋白（圖5）。

圖5 大鰭鳠GHR 蛋白跨膜結構域預測

2.3.2 大鰭鳠GHR 蛋白的磷酸化和糖基化位點預測預測分析結果（圖6）顯示，GHR 蛋白有34 個絲氨酸修飾位點和21 個蘇氨酸修飾位點（圖6A），可能有13 個N-糖基化修飾位點（圖6B）和有91 個O-糖基化修飾位點（圖6C）。

圖6 大鰭鳠GHR 蛋白磷酸化和糖基化位點預測

2.3.3 大鰭鳠GHR 蛋白的結構預測二級結構預測結果顯示，大鰭鳠GHR 蛋白主要是由α-螺旋（20.66%）、延伸鏈（24.13%）和無規則卷曲（55.21%）組成（圖7）。該蛋白的三級結構與二級結構相符（圖8）。

圖7 大鰭鳠GHR 蛋白二級結構

圖8 大鰭鳠GHR 蛋白三級結構預測

2.3.4 大鰭鳠GHR 蛋白的亞細胞定位、功能結構域和蛋白互作分析Cell-Ploc 2.0 在線工具預測結果顯示，大鰭鳠GHR 蛋白主要在細胞膜上發揮作用。由圖9 可知，該蛋白胞外區含有一段22 個氨基酸組成的信號肽序列（1～22 aa）、一個SCOP 結構域（SCOP：38～136 aa）和 一個FN3 結構域（FN3：140～230 aa），跨膜區包括跨膜結構域（254～273 aa），胞內區包含GHBP 結構域（GHBP：374～548 aa）。從圖10 中可知，該蛋白與GH1、GH2、CISH、JAK2 和STAT5A 等存在相互作用。

圖9 大鰭鳠GHR 蛋白結構功能結構域分析

圖10 大鰭鳠GHR 蛋白互作分析

3 討 論

有報道稱，在一些硬骨魚類中存在2 種GHR。該研究通過RCAE 的方法，成功克隆到大鰭鳠的GHR基因，并獲得了其完整的CDS 區序列，該序列包含1 731 個堿基，編碼576 個氨基酸，其蛋白氨基酸數量與其他魚類有所差異。生物信息學分析顯示，大鰭鳠GHR 蛋白包含了一個細胞外配體結合域（253 aa）、一個跨膜結構域（19 aa）和一個胞內信號轉導結構域（174 aa）。大鰭鳠GHR 蛋白屬于跨膜蛋白，其主要定位在細胞膜上，可作為一種分泌蛋白調控多種基因表達[16]。分析發現，大鰭鳠GHR 蛋白也存在信號肽結構，其切割位點位于第22 和23 個氨基酸之間。而信號肽可以把蛋白質引導到不同膜結構的亞細胞器內[17]，從而發揮相應功能。從相似性和進化分析來看，大鰭鳠與黃顙魚和斑點叉尾鮰的親緣關系較近，同源性達到了80%以上，由此說明魚類的GHR基因保守性較好，但是與哺乳動物之間存在較大差異。從大鰭鳠GHR 蛋白的二、三級結構結果來看，GHR 蛋白存在著大量的無規卷曲，占比達到了55.21%，使得其三級結構呈現出復雜的立體結構。

大鰭鳠GHR 蛋白互作分析表明，該蛋白與GH1、GH2、JAK2 和SATA5 等存在緊密的聯系和相互作用。在動物體的生長發育過程中，GH、GHR 所在的GH/IGF 軸發揮著重要的作用。研究表明，GHR 與GH 相結合后，能誘發JAK2 等細胞因子酪氨酸磷酸化，以4條不同的信號通路傳入細胞內引起一系列的生理效應[18]。在絡氨酸激酶JAK2-STAT 信號轉導途徑，GH 與GHR 結合會激活酪氨酸激酶，GHR 信號轉導就起始于此[19]。GH 還能使信號轉導及轉錄活化蛋白（STAT1，STAT3 及STAT5 等）磷酸化，從而調控相關基因的轉錄，進而調節細胞的多種代謝活動[20]。JAK2 信號通路主要涉及信號轉導、信號轉錄因子和活化子（STATS），從而引起下游信號的傳導。