基于網絡藥理學及分子對接分析桃仁紅花煎治療心肌缺血再灌注損傷的作用機制

洪秋語 伍亞男▲ 招浩熙 萬信良

1.貴州中醫藥大學針灸推拿學院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫藥大學第二臨床醫學院，貴州貴陽 550002

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是目前導致患者殘疾和死亡的重要原因之一[1]。恢復冠脈灌注是其治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的基本原則，其中最主要的治療手段是溶栓再通和經皮冠狀動脈介入治療[2]。然而研究顯示，這些再灌注治療手段可能會進一步導致心肌細胞損傷和功能障礙，這一病理過程稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）[3]。MIRI 的發生發展涉及氧化應激，炎癥反應和鈣超載等[4-5]。由于MIRI 的病理機制復雜，且尚無有效的治療方案。因此，針對MIRI 的發病機制進行探索和預防治療具有重要意義。

在中醫理論中，MIRI 可歸屬于“胸痹”“心痛”等范疇，其病機多以瘀血內阻、心氣不足為關鍵，故針對MIRI 宜采用活血散瘀、補益心氣之法[6]。桃仁紅花煎出自《陳素庵婦科補解》卷一，由桃仁、紅花、丹參、香附、延胡索、乳香、青皮、赤芍、川芎、當歸以及生地黃11 味中藥材組成，該方具有理血行氣、化瘀止痛之效，主治心脈痹阻證[7-9]。在現代醫學研究及實踐中，桃仁紅花煎針對缺血所致的心肌損害疾病可發揮良好的治療效果[7-9]。因此，本研究基于網絡藥理學與分子對接技術，預測并分析桃仁紅花煎的成分、靶點及信號通路，進一步探討治療MIRI 的新思路。

1 資料與方法

1.1 桃仁紅花煎的活性成分及其靶點的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選條件，檢索出桃仁、紅花、丹參、香附、延胡索、乳香、青皮、赤芍、川芎、當歸的活性成分和靶點；并通過中藥分子機制的生物信息學分析工具（bioinformatics tool for molecular mechanism analysis of traditional Chinese medicine，BATMAN -TCM，http://lib.cpu.edu.cn/92/7a/c1175a103034/page.htm），以閾值>55、P<0.05為篩選標準，獲得生地黃的活性成分和靶點。

同時，通過中國知網、萬方、中國生物醫學文獻數據庫和維普數據庫，對桃仁紅花煎藥物進行檢索，將其中對MIRI 有明確治療作用的化合物補充納入為活性成分。利用UniProt 數據庫，對已篩選的靶點進行統一化處理，從而轉換為相應的基因名稱。

1.2 MIRI 靶點收集

在DisGeNET 數據庫、OMIM 數據庫中，以“myocardial reperfusion injury”和“myocardial ischemia reperfusion injury”為檢索詞，篩選出并獲取MIRI 疾病靶點。

1.3 交集靶點匯總及韋恩圖制作

通過桃仁紅花煎的潛在治療靶點與MIRI 疾病靶點進行交集匯總，得出共同靶點。1

.4 桃仁紅花煎的活性成分及靶點的網絡構建

對桃仁紅花煎的藥物和靶點用編號進行統一處理：藥物采用大寫首字母為編號，如丹參”的編號為“DS”；唯一成分采用藥物大寫首字母加數字的形式為編號，如YHS1 等；共有成分則以A1 等作為編號。

將整理的數據導入至Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制出桃仁紅花煎“活性成分-靶點”網絡。

1.5 蛋白互作網絡圖的構建

將共同靶點導入STRING 數據庫，進行蛋白互作網絡的拓撲分析，使用Cytoscape 3.8.2 軟件對結果進行可視化處理，制作蛋白互作網絡圖（protein-protein interaction networks，PPI）。

1.6 基因本體分析和京都基因與基因組百科全書分析

通過DAVID 數據庫對桃仁紅花煎治療MIRI 的靶點進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG），物種設定為“Homo sapiens”。根據數據庫的富集分析，選取P值前10 位的結果進行可視化處理。

1.7 分子對接

選取前5 個核心靶點及核心成分，從RCSB PDB數據庫與PubChem 數據庫中分別下載核心靶點與核心成分的結構。將結構文件導入PyMol 2.5.2 及AutoDockTools 1.5.6 軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 桃仁紅花煎的活性成分及其靶點的結果

初步篩選出桃仁紅花煎的活性成分，并補充文獻檢索所得的結果，最終收集到存在靶點的活性成分201 個，其中有35 個為共有活性成分，收集到靶點3170 個。利用UniProt 數據庫對靶點進行注釋并去重，得到303 個潛在治療靶點基因。

2.2 MIRI 靶點整合

整合數據庫的結果，共獲取527 個MIRI 疾病靶點。

2.3 桃仁紅花煎治療MIRI 靶點韋恩圖制作

將活性成分靶點與疾病靶點進行交集分析，獲得86 個桃仁紅花煎治療MIRI 共同靶點。

2.4 桃仁紅花煎的活性成分及靶點的網絡構建

運用Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制出桃仁紅花煎“活性成分-靶點”網絡并獲取桃仁紅花煎治療MIRI的關鍵成分，見圖1 及表1。

圖1 “活性成分-靶點”網絡

2.5 PPI 網絡圖的構建

將數據結果導入Cytoscape 3.8.2 軟件，得到86個節點與1235 條邊，繪制出桃仁紅花煎成分-MIRI 靶點PPI 網絡圖，見圖3。

圖3 GO 富集分析

圖2 桃仁紅花煎成分-MIRI 靶點PPI 網絡

2.6 GO 和KEGG 富集分析

結果顯示，在GO 富集分析中，共預測到了381個條目，生物過程中富集最高的是凋亡過程的負調控，細胞組成富集最高的是細胞外間隙，分子功能富集最高的是酶結合，見圖4。

圖4 KEGG 分析

KEGG 富集分析的結果顯示桃仁紅花煎治療MIRI 的信號通路共114 條，其中核心通路為腫瘤壞死因子信號通路（tumor necrosis factor，TNF）與缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1 signaling pathway，HIF-1）信號通路，見圖5。

2.7 分子對接

根據自由能（affinity）對分子對接結果進行評估，自由能越小，提示受體與配體親和力越強。結果顯示，核心成分與核心靶點對接結果均小于-5 kcal/mol。其中，植物甾醇和TNF 的結合自由能為-9.7 kcal/mol，槲皮素和絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）的結合自能為-9.4 kcal/mol，木犀草素和TNF 的結合自由能為-9.1 kcal/mol。這些成分及靶點自由能較高，可能具有較強的親和性。

3 討論

本研究通過網絡藥理學研究方法，預測得出桃仁紅花煎的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素。其中，槲皮素通過上調沉默信息調控因子1 的表達，發揮對MIRI 的保護作用[10]。β-谷甾醇通過參與氧化應激、炎癥反應和凋亡途徑抑制MIRI 所致的心肌細胞損傷[11]。木犀草素預處理減少促炎細胞因子產生，抑制MIRI 導致的心肌細胞凋亡[12]。以上結果顯示桃仁紅花煎的主要活性成分能一定程度上發揮抗MIRI 作用。

本研究結果顯示，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、TNF 等靶點可能在桃仁紅花煎治療MIRI 中發揮關鍵的作用。AKT1具有調控細胞增殖與凋亡的功能，能夠減輕缺血-再灌注損傷所致的心肌損傷[13]。在MIRI 進程中，促炎因子IL-6、TNF 血清含量的降低，有利于減輕心肌細胞炎癥反應，從而減少心肌梗死面積[14]。丹參可下調AKT1，調控血小板活性，發揮拮抗MIRI 的作用[15]。紅花活性成分可降低MIRI 大鼠血清中IL-6、TNF-α 的含量，達到保護心肌細胞的作用[16]。以上研究一定程度上證明了桃仁紅花煎的主要藥物如丹參、紅花等可以調節重要的核心靶點治療MIRI。

分子對接結果顯示，桃仁紅花煎的核心成分與核心靶點均有較好的親和力，進一步驗證了上述活性成分及靶點預測。

KEGG 結果，顯示桃仁紅花煎治療MIRI 的主要通路可能為TNF 信號通路與HIF-1 信號通路。研究顯示，TNF 信號通路的上調會導致下游靶點核因子-κB 水平的升高，進一步加劇MIRI[17]。HIF-1 信號通路可通過抑制Toll 樣受體4 信號通路的表達，減輕MIRI 大鼠體內炎癥反應[18]。

現代研究發現，桃仁紅花煎能抑制大鼠的IL-6和TNF-α 表達水平，進而達到抗動脈粥樣硬化作用[19]。桃仁紅花煎能顯著抑制大鼠血小板聚集，并具有改善血液流變學的作用[20]。MIRI 的發生與動脈粥樣硬化等心血管疾病以及血小板聚集、血液流變學異常等病理狀態具有密切的關系。同時上述實驗[19-20]所提及的作用靶點，與本次網絡藥理學研究預測結果具有一定的關聯性。

綜上所述，基于網絡藥理學方法預測發現桃仁紅花煎可能通過多成分、多靶點以及多通路治療MIRI，同時分子對接結果顯示桃仁紅花煎活性核心成分與靶點具有良好的結合性，進一步驗證了網絡藥理學的結果。桃仁紅花煎原本用于婦科病的治療，然而經過近現代臨床研究發現，桃仁紅花煎對于心肌缺血類疾病具有良好的治療效果。本研究通過對數據可視化處理分析，預測出桃仁紅花煎干預MIRI 的復雜過程。臨床實踐與生物信息技術預測的結果不僅體現了中醫“異病同治”的治則，更為進一步的動物實驗研究提供理論參考。