低深度全基因組測(cè)序在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中的臨床應(yīng)用

鄭小蔚 黃小蘭 陳小青

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，福建泉州 362000；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院免疫內(nèi)科，福建泉州 362000

迄今為止，經(jīng)過(guò)多年的研究，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）仍然是醫(yī)學(xué)的一個(gè)挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)通常將3 次或3 次以上在孕28 周前的流產(chǎn)稱(chēng)為RSA[1]，但大部分研究認(rèn)為，若連續(xù)發(fā)生2 次及以上的流產(chǎn)，再次出現(xiàn)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之提高，應(yīng)加強(qiáng)重視。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，RSA 的發(fā)病率為1%～3%，約影響3%的孕婦，且早期約占全部RSA 的80%[1-2]。一項(xiàng)前瞻性研究結(jié)果顯示，RSA 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)隨著流產(chǎn)次數(shù)增加而上升，既往的自然流產(chǎn)史是一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，每次流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加約11%，在3 次或3 次以上的流產(chǎn)后約占40%[3]。各種病因，無(wú)論是單獨(dú)的還是聯(lián)合的，都被認(rèn)為是導(dǎo)致流產(chǎn)的原因，包括子宮畸形、感染、母體血栓性疾病、免疫功能障礙、各種內(nèi)分泌紊亂和父母染色體異常[4]。在各種病因中，遺傳因素似乎與生殖損失高度相關(guān)[5-6]。在50%的夫婦中，沒(méi)有明確的病因，在這種情況下，他們被認(rèn)為患有特發(fā)性或無(wú)法解釋的RSA[6]。在29%～60%的病例中，RSA 可由胚胎的染色體畸變引起[7]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2021年10月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的420 對(duì)RSA 患者夫婦作為研究對(duì)象。年齡：男性23～53 歲，平均（33.23±4.68）歲，女性23～45 歲；平均（32.51±3.89）歲；超聲評(píng)估胎停孕齡為7～15 周，納入標(biāo)準(zhǔn)：①同一對(duì)夫婦連續(xù)發(fā)生2 次或者2 次以上流產(chǎn)；②妊娠28 周之前的流產(chǎn)；③表型和智力均正常；④非近親婚配。排除標(biāo)準(zhǔn)：病毒感染及器質(zhì)性病變等因素導(dǎo)致的生殖異常。本研究取得參與研究者的知情同意，并獲得福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色體制備 1 ml 外周血加入5 ml 的人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)液（廣州達(dá)暉生物公司，批號(hào)：X10Y210512）中，于培養(yǎng)箱（Thermo3110 型）內(nèi)培養(yǎng)72 h，加入濃度為100 μg/ml 的秋水仙素（杭州寶榮，批號(hào)：J190801）50 μl 繼續(xù)培養(yǎng)22 min，收獲染色體，常規(guī)染色體制片，行G 顯帶核型分析。外周血染色體核型分析：一般情況下每份標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，記錄所見(jiàn)的任何的數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變，選擇3～5 個(gè)分裂相進(jìn)行核型分析。如果是嵌合體病例，則每一細(xì)胞系至少分析1 個(gè)細(xì)胞，特殊病例應(yīng)加大分析的細(xì)胞數(shù)目至50～100 個(gè)。

1.2.2 胚胎流產(chǎn)物染色體制備 ①采集所有行清宮手術(shù)的早期自然流產(chǎn)孕婦的絨毛組織10 g 并將其置于含有1640 培養(yǎng)液（杭州寶榮，批號(hào)：C1210701）的瓶子中。②在倒置顯微鏡（OLYMPUS，型號(hào)：IX53P1F）下挑選收集到的患者絨毛組織，選擇約5 g 左右分支明顯的絨毛。③利用1640 培養(yǎng)液對(duì)絨毛組織進(jìn)行漂洗后將其剪碎，保證整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行。④將準(zhǔn)備好的絨毛組織置于含2 ml，250 U/L 膠原酶Ⅱ（CAS：9001-12-1）的離心管內(nèi)并放置于含有5%CO2的培養(yǎng)箱（Thermo3110 型）內(nèi)靜置10 min。⑤開(kāi)蓋后置于40℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存，第二天可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)采集的絨毛細(xì)胞并制備染色體。胚胎流產(chǎn)物染色體核型分析：一般情況下每份標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)20 個(gè)分裂相，記錄所見(jiàn)的任何的數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變，選擇3～5個(gè)分裂相進(jìn)行核型分析。如果是嵌合體病例，則每一細(xì)胞系至少分析1 個(gè)細(xì)胞，特殊病例應(yīng)加大分析的細(xì)胞數(shù)目至50～100 個(gè)。

1.2.3 胚胎流產(chǎn)物組織低深度全基因組測(cè)序 試劑采用華大生物科技（武漢）有限公司的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法），儀器采用深圳華大基因生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的基因測(cè)序儀（BGISEQ-500）。①流產(chǎn)物組織樣品準(zhǔn)備及DNA 提取；②文庫(kù)構(gòu)建打斷；③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）；④Poolin 構(gòu)建好文庫(kù)經(jīng)Agilent2100 Bioanalyzer 及實(shí)時(shí)定量，基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)（real-time polymerase chain reaction，QPCR）檢測(cè)合格后，將一定量的文庫(kù)按照等物質(zhì)的量混合，上機(jī)測(cè)序（BGISEQ-500）后進(jìn)行信息分析。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察RSA 孕婦外周血結(jié)果、胚胎染色體結(jié)果、胚胎染色體低深度全基因組測(cè)序（copy number variation sequencing，CNV-seq）結(jié)果，分析孕婦年齡、流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常的關(guān)系。采用染色體G 顯帶進(jìn)行外周血染色體核型分析、胚胎染色體核型分析，核型描述遵循《人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》（ISCN2016）[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布。所有計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用率表示。高通量數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析軟件采用染色體非整倍體分析軟件來(lái)自華大生物科技（武漢）有限公司。

2 結(jié)果

2.1 RSA 孕婦外周血結(jié)果的分析

420 對(duì)RSA 孕婦外周血染色體有42 對(duì)異常核型，陽(yáng)性率10%，其中染色體平衡易位20 對(duì)，占47.6%，羅伯遜易位3 對(duì)，占7.1%，染色體多態(tài)性15 對(duì)，占35.7%，性染色體異常2 對(duì)，占4.8%，染色體嵌合2對(duì)，占4.8%。

2.2 胚胎染色體結(jié)果的分析

420 對(duì)RSA 胚胎組織染色體，成功383 對(duì)，有113 對(duì)異常核型，陽(yáng)性率29.5%，其中染色體平衡易位10 對(duì)，占2.6%，羅伯遜易位8 對(duì)，占2.1%，染色體多態(tài)性15 對(duì)，占3.9%，性染色體異常20 對(duì)，占5.2%，染色體嵌合13 對(duì)，占3.4%，三體35 對(duì)，占9.1%，結(jié)果正常270 對(duì)，占70.5% 。

2.3 胚胎染色體CNV-seq 結(jié)果的分析

420 對(duì)胚胎染色體檢出異常結(jié)果362 對(duì)，占86.2%，陰性結(jié)果58 對(duì)，占13.8%，非整倍體中，單體以45，X 最多，三體以16 三體最多（表1）。

表1 420 例胚胎染色體結(jié)果分析

2.4 孕婦年齡、流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常的關(guān)系

420 對(duì)RSA 孕婦根據(jù)年齡分3 個(gè)亞組，年齡≥40歲組染色體異常核型發(fā)生率34.2%，占比最高；年齡20～<30 歲組的染色體異常核型發(fā)生率最低。根據(jù)流產(chǎn)次數(shù)，流產(chǎn)3 次的異常核型占比最高，為37.8%，其次是流產(chǎn)3 次以上（表2）。

表2 年齡、流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常的關(guān)系

3 討論

夫婦外周血和/或胚胎染色體異常是引起早期RSA 的常見(jiàn)病因。國(guó)外有學(xué)者在長(zhǎng)達(dá)20年的研究期間（1996-2016年），對(duì)627 對(duì)RSA 患者夫婦進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，檢測(cè)出69 對(duì)（11.00%）夫婦存在染色體異常[9]。臨床上常見(jiàn)的有染色體易位，主要是相互易位（61%）和羅伯遜易位（16%）、基因多態(tài)性、臂內(nèi)倒位、臂間倒位及性染色體異常，此外還有插入、缺失等[10]。本研究對(duì)420 對(duì)RSA 患者夫婦行外周血染色體檢測(cè)，有42 例異常核型，陽(yáng)性率10%，與國(guó)外的研究結(jié)果相符[11]。在3%～6%的RSA 夫婦中，一方有基因平衡的染色體結(jié)構(gòu)重排。這種平衡易位占核型異常的最大比例[12]。這種異常配子的臨床后果包括反復(fù)流產(chǎn)、死產(chǎn)、出生畸形兒童和智力殘疾兒童[13]。如果夫婦任何一方是同源羅伯遜易位攜帶者，胚胎染色體可能出現(xiàn)單體或者三倍體，那么胚胎可能早期自然流產(chǎn)；如果夫婦為非同源羅伯遜易位攜帶者，胚胎染色體可能出現(xiàn)重復(fù)或缺失，大約2/3 的子代可能出現(xiàn)流產(chǎn)或畸形。如果妻子攜帶缺陷X 染色體，可能因偏斜X染色體的不對(duì)稱(chēng)失活及低頻率X 單體嵌合體的異常高發(fā)率導(dǎo)致RSA[14-15]。在人類(lèi)染色體中，9 號(hào)染色體為出現(xiàn)較高頻率的多態(tài)性，一般情況下，個(gè)體間出現(xiàn)1%～2%的變異遵循孟德?tīng)栠z傳定律[16]。Ueharas 等[17]報(bào)道，inv（9）與有不孕癥和多次流產(chǎn)有關(guān)。男性患者隨著年齡的上升，精子染色體異常也隨之增高，特別是非整倍體，有研究者對(duì)精子進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示，在RSA 患者中，男方精子的非整倍體率顯著增加[18]。近年來(lái)，國(guó)外有研究顯示中國(guó)男性攜帶復(fù)雜染色體重排者（complex chromosomal rearrangement，CCR）也會(huì)引起RSA 的增加[19]。對(duì)CCR 累及的染色體及斷裂點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，累及6 號(hào)、7 號(hào)、8 號(hào)、11 號(hào)和16 號(hào)染色體的CCR 多會(huì)出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局，斷裂點(diǎn)出現(xiàn)在2q31、5q35 和8ql3 時(shí)RSA 多見(jiàn)。有報(bào)道稱(chēng)Y 染色體微缺失與RSA 并無(wú)相關(guān)性[20]。

研究顯示，在RSA 中胚胎染色體異常發(fā)生率較夫婦染色體異常高，胚胎染色體出現(xiàn)非整倍體是最常見(jiàn)的流產(chǎn)因素，尤其是在妊娠早期[21]。國(guó)外有一項(xiàng)前瞻性研究顯示，隨著女性年齡的上升，卵母細(xì)胞非整倍體和多倍體的發(fā)生率升高，尤其是高齡女性（>35歲），RSA 的發(fā)生率也明顯增加[22]。本研究結(jié)果顯示，胚胎染色體非整倍體異常的患者年齡也以高齡（>35 歲）居多。Yang 等[23]對(duì)182 例妊娠患者均進(jìn)行G 顯帶細(xì)胞遺傳學(xué)分析和新型高通量連接依賴(lài)探針擴(kuò)增（high-throughput ligation-dependent probe amplifica tion，HLPA）技術(shù)，以檢測(cè)染色體異常。對(duì)74 例患者進(jìn)行低覆蓋全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS），檢測(cè)拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。WGS 提示RSA 組致病性CNVs 發(fā)生率高于對(duì)照組。在自然流產(chǎn)患者中，核型異常和致病性CNVs的發(fā)生率較高。周靜等[24]共發(fā)現(xiàn)1040 例異常核型，發(fā)生率為44.86%（1040/2318），占異常核型的73.24%（1040/1420），是胚胎早期停止發(fā)育的重要原因，以16三體發(fā)生頻率最高，其次是22 三體、45X 及多重非整倍體。本研究結(jié)果顯示，420 對(duì)胚胎染色體異常中以X 號(hào)染色體發(fā)生頻率最高，其次是16 染色體為多見(jiàn)，21 號(hào)染色體及22 號(hào)染色體最常見(jiàn)三體異常，CNV-seq共檢出有致病意義的有109 對(duì)，包含了一些臨床意義明確的基因組，dup（9）（p24.3p11.1）區(qū)域約47.31 Mb的重復(fù)與小耳畸形，生長(zhǎng)遲緩有關(guān)[25]，del（3）（q11.1q11.2）與常染色體顯性蛋白S 缺乏性血栓形成傾向有關(guān)[26]，dup（13）（q11q21.33）主要臨床表現(xiàn)為身材矮小、智力低下、主動(dòng)脈縮窄、面部畸形、共濟(jì)失調(diào)、輕度痙攣步態(tài)和大頭畸形等[27]。del（1）（p36.21p36.33）有相關(guān)綜合征“chromosome 1p36 deletion syndrome”的報(bào)道[28]。

RSA 的患病率逐年增高，胚胎染色體異常是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因，而染色體非整倍體數(shù)目異常最為常見(jiàn)，本研究建議，臨床診療實(shí)際工作中，應(yīng)重視遺傳學(xué)病因的篩檢，G 顯帶染色體核型分析培養(yǎng)作為流產(chǎn)查因的臨床常規(guī)檢測(cè)，但由于其培養(yǎng)過(guò)程比較繁瑣，且分辨率>5 M，應(yīng)用受到一定的限制，CNV-seq 近幾年飛速發(fā)展，將CNV-seq 應(yīng)用于臨床流產(chǎn)查因，對(duì)于不明原因的RSA 者，明確流產(chǎn)的遺傳學(xué)檢測(cè)有助于探求可能的遺傳學(xué)因素和父母雙方遺傳學(xué)異常的線索，為再次妊娠提供有針對(duì)性的孕前優(yōu)生措施，還可為再次妊娠進(jìn)行胚胎植入前診斷或產(chǎn)前診斷提供遺傳學(xué)依據(jù)。隨著輔助生殖技術(shù)發(fā)展，胚胎染色體異常導(dǎo)致的RSA 或可通過(guò)一些新技術(shù)手段進(jìn)行干預(yù)，如胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)[29]等來(lái)降低RSA 發(fā)生的概率。為臨床精準(zhǔn)診療提供了新的思路和方法，為深入了解RSA 遺傳學(xué)病因及開(kāi)展大規(guī)模臨床實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，染色體檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)RSA 的準(zhǔn)確診斷從而用于預(yù)防。本研究選用染色體細(xì)胞培養(yǎng)G 顯帶分析技術(shù)和CNV-seq 對(duì)絨毛細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查，結(jié)合夫婦雙方染色體分析進(jìn)行綜合評(píng)估，明確RSA的病因，為臨床提供合適的指導(dǎo)，指導(dǎo)患者安全備孕避免RSA 的再發(fā)生。