淫羊藿素對人肝癌Hep-G2細胞增殖、凋亡的影響及作用機制

鄔仁華 董猛 白娟 卿毅 李玲

(成都大學附屬醫院腫瘤科，四川 成都 610000)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大癌癥，具有發病率高和死亡率高的特點，中國患者數量及死亡率均居世界之首[1-2]。據統計，HCC患者5年生存率不足30%，盡管目前治療肝癌的方法較多，但效果并不盡人意[3-4]。因此，HCC的預防以及治療已成為癌癥研究的熱點。近年來，研究發現許多中藥具有抗腫瘤的效果，不僅可以抑制腫瘤細胞的生長和轉移，同時還具有副作用小的特點[5-6]。淫羊藿是藥用價值極高的傳統植物中藥之一，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤等諸多功效，其主要活性成分包含淫羊藿苷、淫羊藿素等[7]。其中，淫羊藿素被證實具有抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的能力，且與腫瘤細胞的凋亡可能也存在一定關系，已被用于抗子宮內膜癌、乳腺癌、肝癌等多方面的研究[8]。目前，有關淫羊藿素對人肝癌Hep-G2細胞抗增殖及凋亡的作用機制仍在討論中，為進一步研究淫羊藿素調控人肝癌Hep-G2的惡性生物學特征，本研究觀察了淫羊藿素對人肝癌Hep-G2細胞增殖、凋亡的影響及其對相關基因的影響，旨在探討其作用機制，以期為臨床治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要細胞 Hep-G2細胞由中國科學院細胞庫提供。

1.2 主要試劑與儀器 淫羊藿素(CSA：5240-95-9；批號：20190108)購自寶雞市國康生物科技有限公司；細胞培養所需青霉素購自哈藥集團制藥總廠；培養基(名稱：RPMI-1640培養基、DMEM基礎培養)購自自賽默飛世爾科技公司；Bcl-2抗體(貨號：sc-56015；批號：20190603)、Bax抗體(貨號：sc-70407；批號：20190606)購自Santa Cruze Biotechnology 公司；Ki67抗體(貨號：ab205718)購自Abcam中國公司；凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；熒光分光光度計(型號：722)購自賽默飛公司；細胞培養箱購自美國Forma公司；臺式低溫離心機(型號：JIDI-16R)購自廣州激迪儀器有限公司；光學顯微鏡(型號：NE-600)購自深圳市博視達光學儀器有限公司；蛋白電泳及轉膜儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 將人肝癌Hep-G2細胞培養于RPMI-1640培養基中，在培養基中添加100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素，放入細胞培養箱內培養，培養箱設置為37℃恒溫，調整CO2濃度為5%。

1.3.2 分組干預 將細胞分為：空白對照組，低、中、高劑量組，低、中、高劑量組分別使用2.5、5、10 μM/L的淫羊藿素處理。

1.3.3 MTT法檢測細胞的增殖情況[9]將各組對數生長期人肝癌Hep-G2細胞以5000個/空接種于96個孔板中，貼壁生長后分別用 0、0.05、0.5、5、50 μM/L的淫羊藿素RPMI-1640培養液繼續培養72 h，加入MTT溶液后使用DMSO溶解使用分光光度計檢測570 nm波長處的光密度值，并計算細胞的抑制率，抑制率(%)=[(1-藥物組A值)/空白對照組A值]×100%。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達水平 取上述培養的肝癌Hep-G2細胞，使用恒溫離心機在4℃的恒溫條件下離心10 min，加入裂解液后再加入Loading Buffer 緩沖液。測定蛋白濃度后，電泳提取總蛋白并將蛋白轉移到PVDF膜后加入一抗液中孵育過夜。加入Ki67(稀釋倍數1：500)、Bax (稀釋倍數1：500)、Bcl-2(稀釋倍數1：500)、Caspase-3(稀釋倍數1：500)；以β-actin (稀釋倍數1：1000)為內參蛋白，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

1.3.5 克隆形成實驗檢測Hep-G2細胞增殖情況[10]取上述細胞，在每個孔板中加入2.6 mL溶液并調節細胞濃度至1×103個/mL，十字輕輕晃動使細胞分散均勻。將細胞培養皿放入37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養2周后使用結晶紫染色計算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆數/所種細胞數)×100%。

1.3.6 流式細胞儀檢測Hep-G2細胞凋亡情況[11]取上述細胞，4℃恒溫1000 r/min離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入試劑盒中的緩沖液混勻，再加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混合，4℃避光孵育20 min，采用流式細胞儀進行上樣檢測，CellQuest軟件分析計算Hep-G2細胞凋亡率。避光孵育15 min后上機檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 MTT結果 當使用淫羊藿素劑量為0.05 μM/L時候抑制率為4.00%；當使用淫羊藿素劑量為0.5 μM/L時候抑制率增加至13.00%(P<0.05)；當使用淫羊藿素劑量為5 μM/L時候抑制率增加至48.30%(P<0.05)；當使用淫羊藿素劑量為50 μM/L時候抑制率增加至89.50%(P<0.05)，見圖1。

2.2 相關增殖蛋白表達情況 與空白對照組相比，低劑量組Ki-67蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組Ki-67蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組Ki-67蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖情況 由克隆形成實驗可以看出，與空白對照組克隆形成率[(78.00±6. .00)%]相比，低劑量組克隆形成率[(60.50±4.05)%]顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組克隆形成率[(43.50±2.00)%]顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組克隆形成率[(20.00±2.00)%]顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 由流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡情況可以看出，相比空白組細胞凋亡率(8.90±9.00)%，低劑量組細胞凋亡率[(24.60±4.90)%]顯著上升(P<0.05)；相比低劑量組，中劑量組細胞凋亡率[(52.39±6.00)%]顯著上升(P<0.05)；相比中劑量組，高劑量組細胞凋亡率[(79.36±10.00)%]顯著上升至(P<0.05)，見圖4。

2.5 凋亡相關蛋白表達情況 由蛋白質印記實驗可以看出，與空白對照組相比，低劑量組促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白相對表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3相對表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達水平顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組促凋亡蛋白Bax、Caspase-3相對表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

3 討論

肝癌是臨床較為常見的腫瘤之一，起病隱匿，早期并無典型臨床癥狀，但發病后病情進展迅速，對患者的生命安全造成巨大威脅[12]。盡管隨著醫學技術的不斷發展，肝癌的診斷及治療手段已取得一定進展，但仍有部分患者的臨床結局較差。因此，對肝癌患者死亡率的控制仍然是醫學工作中的一個難點，探索新的治療藥物有重要的積極意義。

近年來，使用中藥治療肝癌具有較好的效果。淫羊藿是傳統中藥中的一味補益藥材，其作為傳統中藥用于治療各類疾病已有悠久歷史。早期研究發現，淫羊藿具有保護心腦血管、提高人體免疫力、促進骨代謝等功能，近年來有學者報道，其除了在內分泌、免疫系統方面發揮效用外，還具有抗腫瘤作用[13]。現代藥理研究表明[14]，淫羊藿中的一種重要活性成分——淫羊藿，能抑制多種腫瘤細胞的增殖、轉移，誘導腫瘤細胞凋亡，因此被認為是一種具有廣泛應用前景的抗癌藥物之一。

腫瘤細胞的惡性增殖是腫瘤發展的重要因素之一。張淑琴等[15]比較了淫羊藿素抑制人腎癌細胞786-O、人肺癌細胞A549及人肝癌細胞HepG2共3種腫瘤細胞增殖的效果，發現其對上述3種腫瘤細胞的增殖均有明顯抑制作用。本研究通過MTT實驗發現，使用淫羊藿素可以有效抑制肝癌細胞的增殖，且隨著使用濃度的升高其抑制效果顯著增強，這與張淑琴等[15]的研究結論類似。使用淫羊藿素對肝癌細胞的半數致死濃度(IC50)為5.38 μM/L。本實驗選取0、0.5、5、10 μM/L四個濃度用于后續對HepG2細胞增殖、凋亡表達影響的探討。通過克隆形成實驗發現，與空白對照組比較，當使用不同濃度的淫羊藿素溶液處理HepG2細胞時，細胞克隆形成率出現明顯下降，且克隆形成率隨淫羊藿素溶液的增大而下降，提示淫羊藿素對于HepG2細胞的增殖能力具有良好的抑制作用，這與本研究中此前的MTT實驗結果所對應。同時，本研究進一步通過Western blot實驗檢測了增殖相關蛋白Ki-67的表達水平。Ki-67是常見的調控細胞增殖的蛋白之一，既往文獻顯示，其表達水平與增殖能力呈正相關[16]。本研究發現，與空白對照組相比，使用淫羊藿素處理后肝癌細胞的增殖受到了顯著抑制，說明淫羊藿素可以抑制肝癌細胞的增殖。黃佳彬[17]研究表明，淫羊藿素能夠通過調控有絲分裂的相關蛋白使肝癌Hep G2細胞S期被阻滯，這可能是淫羊藿素抑制細胞增殖的機制之一。

本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示，與空白對照組比較，當使用淫羊藿素溶液處理HepG2細胞時，細胞凋亡率顯著增高，提示淫羊藿素可誘導HepG2細胞發生凋亡。細胞凋亡是其重要的生物學特征，這種生物學特征收到相關蛋白的調控目前研究較多的包括Bcl-2家族和Caspase家族[18-19]。李晶等[20]研究表明，淫羊藿素可以調控活化型肝星狀細胞系HSC-T6(大鼠)中Bax及Caspase-3的表達，調控HSC-T6細胞的凋亡。本研究在人肝癌HepG2細胞中發現了類似的結論，相比空白對照組，使用淫羊藿素處理后的各組肝癌細胞Bax、Caspase-3蛋白相對表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著降低。這說明淫羊藿素可以有效抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并促進凋亡蛋白Bax的表達，激活Caspase家族的凋亡啟動子Caspase-3，從而促進人肝癌HepG2細胞的凋亡。

4 結論

淫羊藿素可以抑制肝癌Hep-G2細胞增殖并促進其凋亡，其作用機制可能與下調Bcl-2蛋白和上調Bax蛋白的表達以及增強caspase-3的活性相關。