辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的干預效果及作用機制*

孫威 宮政 翟悅 袁媛媛

(沈陽市骨科醫院藥劑科，遼寧 沈陽110044)

腦血管疾病為臨床常見、多發疾病，其較高的致殘、致死率嚴重威脅人類生活質量及生命健康[1]。臨床資料顯示，腦缺血起病急、進展快，其卒中發病率占全部卒中發病率的75%以上，且呈年輕化趨勢[2]。資料[3]表明，腦缺血-再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)發病機制較為復雜，且多因素參與并涉及多個作用環節，其相互作用，引發系列級聯反應。目前，臨床尚無特效治療藥物，因此尋找高效低毒的新藥仍作為腦神經領域的研究熱點。隨研究深入發現，辛伐他汀對腦CIRI具有一定保護作用，但臨床尚不清楚其防治CIRI的作用機制，且有關辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷研究報道較少[4-5]。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷模型給予辛伐他汀干預，旨在探討其對腦缺血再灌注損傷的干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取40只健康SPF級SD雄性大鼠，體重210～239 g，平均體重(224.5±12.3)g，由山東魯抗醫藥股份有限公司(合格證號：SCXK 魯20130001)提供。實驗動物于術前自由飲食、飲水，飼養環境恒溫濕度45%～55%，溫度(20.54±2.00)℃，12 h循環光照，維持基礎狀態。實驗結束后，本研究所選取大鼠處理方法均符合動物倫理處置要求，且本研究獲我院倫理委員會批準。

1.2 動物模型制備及分組 參照Longa等[6]研究中大腦中動脈栓塞再灌注模型制備方法，并進行改良。手術前夜禁食，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，在頸部作一正中切口，分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸總動脈、頸外動脈。于總動脈開口處將預先處理好的尼龍線(長4 cm，線直徑0.26～0.28 mm，頭端直徑0.36 mm)緩慢插入頸內動脈入顱方向，以頸總動脈分叉處為標記，插入深度1.8～2.1 mm稍感阻力停止，阻斷大腦中動脈所有血液供應，實現右側大腦中動脈栓塞缺血，2 h后退出線栓是大腦中動脈再通，實現大腦中動脈的缺血后再灌注。注意術中室溫嚴格控制在23℃～25℃。建模過程中死亡3只，成功27只，隨機分為模型組、小劑量組、高劑量組，每組9只，對各組大鼠分別進行干預，參考人與動物體表面積等效劑量比值，計算大鼠給藥劑量，以1/2等效劑量為小劑量，2倍為高劑量，小、高劑量組大鼠分別尾部靜脈注射20 mg/kg、40 mg/kg辛伐他汀，正常組、模型組大鼠給予等劑量生理鹽水干預。

1.3 標本采集、HE染色 干預1周后對大鼠行麻醉處理，斷頭法處死，取出腦組織，剪取部分腦組織制備勻漿液。取大鼠海馬區腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，完全浸泡，5%酸鈉脫鈣處理，24 h后常規包埋、切片處理，以不同濃度酒精進行復水。蘇木精染色15 min，后以1%伊紅染色，封片處理后以顯微鏡進行觀察。

1.4 指標評估

1.4.1 腦組織含水量、腦梗死體積、神經功能損傷程度評估 腦組織含水量：再灌注72 h后將大鼠處死，取出梗死側大腦半球，稱重腦組織濕重后置于100℃烤盤內烘烤至恒重，后稱量腦組織干重。腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。腦梗死體積：每組隨機選取6只大鼠麻醉處死，將腦組織切成2.0 mm切片并浸入2% TTC內30 min，將染色處理腦梗死組織呈灰白色，正常腦組織呈玫瑰紅色。將切片于4%多聚甲醛內固定，以Image J圖像分析系統計算腦梗死體積。腦梗死體積百分比=(正常側半球體積-梗死側肺梗死去大腦半球體積半球面積)/正常側大腦半球體積。神經功能損傷程度：采用改良Lon-ga五點量表評分系統對大鼠神經功能損傷進行評估。0分無神經功能障礙；1分為尾巴提起后向對側前肢屈曲；2分為行走時原地打轉，靜止時身體未偏向對側；3分為行走時實原地打轉，靜止時身體偏向對側；4分為嚴重意識障礙，無法自發行走。

1.4.2 Morris水迷宮實驗 備圓形水池，直徑150 cm、高50 cm，分別標記4個點位，注入半池水，水溫27℃。在水池中央放入一個高30 cm、直徑10 cm平臺。于再灌注第5 d開始實驗，共進行5 d。前4 d將大鼠面朝水池內壁放于水中，并開始攝像記錄。大鼠找到站臺并停留30 s，若找不到站臺則用引導棒引導至站臺停留30 s。將大鼠移出，30 s將大鼠以同樣方式放入另一個象限，直至4個象限全部完成。記錄潛伏期(找到站臺時間)。第5 d撤除平臺，記錄大鼠在60 s內第三象限活動時間及穿越站臺次數。潛伏期越短，第三象限活動時間和穿越次數越多，表明大鼠學習、記憶能力越強。

1.4.3 雙抗體夾心ELISA法檢測腦組織勻漿液白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平各組細胞置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，按照1：2比例稀釋樣品；于每孔內加入100 μL已稀釋好的待測血清和標準品，37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；后以專用的洗滌液重復洗滌反應板，再加入1：100稀釋的抗體工作液100 μL/孔，37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入IL-1β、TNF-α、hs-CRP、GSH-Px、SOD、MDA溶液100 μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液100 μL/孔終止反應，分別用酶標儀在450 nm波長測定IL-1β、TNF-α、hs-CRP、SOD水平，340 nm波長測定GSH-Px含量，532 nm波長測定MDA含量。

2 結果

2.1 大鼠腦組織病理圖 正常組：腦組織結構完好，細胞核清晰可見；模型組：存在明顯炎性細胞浸潤情況；小劑量組：可見炎性細胞浸潤情況，腦組織結構較為完整；高劑量組：炎性細胞親潤情況相對較輕，細胞排列較為規則。見圖1。

2.2 各組大鼠腦組織含水量、腦梗死體積、神經功能損傷評估 相比正常組，模型組大鼠腦組織含水量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；相比模型組，小劑量組、高劑量組大鼠組織含水量、腦梗死面積、神經功能損傷評分較低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠腦組織含水量及神經功能損傷評估

2.3 各組大鼠學習記憶能力評估 與正常組相比，模型組、小、高劑量組大鼠各時間點躲避潛伏期較長，第三象限活動時間、穿越站臺次數較低，差異有統計學意義(均P<0.05)；相比模型組、小劑量組，高劑量組大鼠各時間點躲避潛伏期較低，第三象限活動時間、穿越站臺次數較高，差異有統計學意義(均P<0.05)。 見表3。

表3 Morris水迷宮實驗Table 3 Morris water maze test

2.4 各組炎性因子水平比較 與正常組相比，模型組大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平升高，差異有統計學意義(均P<0.05)；相比模型組、小劑量組，高劑量組大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平較低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 各組炎性因子水平比較Table 4 Comparison of inflammatory factors in each group

2.5 GSH-Px、SOD、MDA水平比較 與正常組相比，模型組大鼠GSH-Px、SOD水平較低，MDA水平較高，差異有統計學意義(均P<0.05)；相比模型組、小劑量組，高劑量組大鼠GSH-Px、SOD水平升高，MDA水平降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 GSH-Px、SOD、MDA水平比較Table 5 Comparison of GSH Px，SOD and MDA levels

3 討論

臨床實踐證實，腦缺血再灌注損傷作為影響治療效果的重要危險因素，與炎癥反應、氧化應激及興奮性氨基酸毒性等多種機制相關。相關學者指出，腦缺血再灌注的主要治病機制與炎性反應與氧化損傷的發生密不可分[7-8]。

本研究發現，辛伐他汀可改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能及認知能力。研究指出，辛伐他汀憑借良好抗炎、抗氧化效果被廣泛應用于腦缺血性疾病中，對改善神經功能損傷、降低短暫性缺血及卒中的死亡率具有重要意義[9-12]。楊曉煒等[13]研究中證實，他汀類藥物可改善大鼠腦缺血再灌注損傷，減輕神經損傷程度，提高認知能力。本研究結果顯示，以辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠進行干預，大鼠神經功能損傷、梗死體積降低、Morris水迷宮實驗潛伏期降低、活動時間及平臺穿越次數增加，形成此結果的原因可能與辛伐他汀良好的神經保護作用相關。由此得出，辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷具有良好的干預效果。

本文研究發現，辛伐他汀可有效抑制腦缺血再灌注損傷產生的炎性反應及氧化應激反應。研究表明，炎癥反應、氧化應激反應在腦缺血再灌注損傷中扮演重要角色[14-16]。IL-1β、TNF-α、hs-CRP等作為典型炎性因子，其異常表達激活大量炎癥介質，使得炎癥反應加重造成腦組織損傷、壞死，形成梗死灶。而血清hs-CRP更被認為是缺血再灌注損傷發生的獨立預測指標[17-18]。相關研究[19-20]證實，TNF-α、hs-CRP參與大鼠腦缺血再灌注損傷的發生、發展。通過給予阿托伐他汀干預，TNF-α、hs-CRP水平降低，且隨劑量增加對炎癥的抑制作用升高，與本文研究內容相符，但因干預措施、樣本納入量不同等因素影響，研究結果可能存在一定偏倚。腦梗死發生后細胞、自由基等發生系列病理生理變化，加重功能損傷[21-23]。研究證實，腦組織在氧化應激條件下受到抗氧化酶保護，有效清除有害自由基。自由基在缺氧缺血狀態下的生成速度超過機體清除速度造成氧化應激損傷[24-25]。本研究結果顯示，通過辛伐他汀干預腦缺血再灌注損傷大鼠，IL-1β、TNF-α、hs-CRP、MDA水平降低，GSH-Px、SOD水平升高，提示辛伐他汀可有效抑制腦缺血再灌注損傷產生的炎性、氧化應激反應，發揮良好的抗炎、抗過氧化作用。由此得出，辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用可能與影響、調節炎性反應及氧化應激反應相關。

4 結論

辛伐他汀能夠減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，縮小梗死面積，提高神經功能，形成這種保護作用可能與抑制炎癥和抗過氧化損傷相關，為抗腦缺血再灌注損傷藥物研究提供重要理論依據。但本研究樣本量較小、觀察時間有限，未對不同再灌注時間及藥物使用劑量進行研究，需進一步增加樣本量對干預效果進行深入研究。