基于TLR4/MyD88/NF-κB通路異甘草素對大鼠顱腦外傷后炎癥反應及Th1/Th2失衡的影響*

孫博蕊 孫杰瑜 李志鵬 蘇志強

(1. 中國醫科大學附屬第一醫院手術室，遼寧 沈陽 110000；2. 中國醫科大學附屬第一醫院腎內科，遼寧 沈陽 110000；3. 中國醫科大學附屬第一醫院神經外科，遼寧 沈陽 110000；4. 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經內科，黑龍江 哈爾濱 150000)

顱腦外傷(Traumatic brain injury，TBI)是由外力作用引起的正常大腦功能損傷，主要由跌倒、暴力和交通事故等造成，是45歲以內成人致殘和死亡率高的首要原因[1]。盡管大多數神經損傷是有限和暫時性的，TBI仍留有多種后遺癥，包括睡眠障礙、垂體功能減退、癲癇以及神經退行性疾病[2]。事實上，TBI被廣泛認為是神經退行性疾病的危險因素，其特征為神經元或髓鞘緩慢進行性喪失和殘疾增加(如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病和多發性硬化癥等)，值得注意的是，不同類型TBI患者患神經退行性疾病的風險往往會增加[3]。苷草是一種多年生草本豆科植物，以根或根莖入藥，富含甘草苷、三萜皂苷、異甘草素(Isoliquiritigenin，ISL)等多種有效成分[4]。ISL提取自甘草根部，是一種具有查爾酮結構的黃酮類化合物[5]，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等藥理活性，且能擴張動脈，起到保護心臟和大腦作用[6]。研究表明，ISL能降低糖尿病神經病變大鼠氧化損傷，并可降低核轉錄因子-κB (Nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)活性發揮對膿毒癥小鼠腦損傷的保護作用[7]。此外，ISL可通過抑制氧化應激降低缺血再灌注所致的損傷[8]。本研究通過建立TBI模型，初步探討ISL對TBI大鼠的影響，為ISL相關藥物研發及臨床治療TBI提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 選取60只SPF級雄性健康大鼠，體質量(200±20)g，8周齡，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可：SCXK (滬)2018-0004，購入后保持室內溫度(24±1)℃，空氣相對濕度(60±10)%，光照晝夜交替循環12 h，室溫下飼養1周。本研究通過醫院動物倫理委員會審核同意。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 異甘草素，純度98%，北京solarbio科技有限公司；甘油果糖氯化鈉注射液，國藥準字：H20055446，揚子江藥業集團有限公司；IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-αELISA試劑盒，美國Sigma公司；蛋白BCA試劑盒，美國R&D公司；兔抗Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)TLR4單抗、髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)單抗、核轉錄因子-κB p65(Nuclear transcription factor-kappa B p65，NF-κB p65)單抗、磷酸化核轉錄因子-κB p65(P-hosphorylated nuclear transcription factor-kappa B p65，p-NF-κB p65)單抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單抗，羊抗兔二抗-HRP，英國Abcam公司；重錘擊打裝置，徐州電子技術開發有限公司；電泳儀、垂直電泳槽，美國Satan Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組 隨機選取50只大鼠術前禁食禁水8 h，腹腔注射體積分數為1%的戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉，待麻醉生效后，將大鼠俯臥并固定于腦立體定向儀，剃除術區毛發、消毒，無菌環境下沿中線矢狀位切開頭部，剝離骨膜，暴露中線顱頂骨，采用牙科鉆在冠狀縫后、中線旁區域鉆打骨窗(直徑5 mm左右，且硬膜完整)，使用重錘擊打裝置進行擊打，選擇40 g的圓柱形擊錘，高度為20 cm，自由落體擊打骨窗，致使大鼠顱腦損傷，撞擊后在大鼠腦部切口處滴入硫酸慶大霉素(40000 U，4～5滴)預防傷口感染，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮后放回飼養籠飼養(25℃恒溫)，并自由進食水。當大鼠呼吸出現數秒暫停、四肢抽搐、且麻醉失效后無偏癱等現象，即為造模成功[9]。取建模成功后40只大鼠(6只死亡，4只無任何癥狀)隨機分為模型組、ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽性藥物組，每組10只；另取10只大鼠作為對照組，不進行任何擊打處理。

1.2.2 干預方法 建模成功后24 h，參照文獻[4]用量，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽性藥物組分別給予20 mg·kg-1、40 mg·kg-1異甘草素溶液及20 mg·kg-1甘油果糖氯化鈉注射液120 μL，給予對照組與模型組等量生理鹽水，1次/d，共計6周。

1.2.3 標本采集 末次給藥后24 h，抽取大鼠腹部主動脈血，離心取血清，-20℃冰箱保存備用。處死大鼠，無菌剝離腦組織，一部分置于體積分數4%多聚甲醛固定備用，余下-80℃存儲備用。

1.2.4 血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量測定 取-20℃保存備用血清，離心取上清(5000 r·min-1，10 min，離心半徑20 cm)，ELISA法檢測IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量?？贵w包被過夜(100 μL，37°C，60 min)、洗滌，加待測樣品(100 μL，37℃，60 min)、洗滌，加入酶標抗體(0.1 mL，37℃，1 h)、洗滌，加底物液避光顯色(90 μL，37℃，15 min)，添加終止液停止反應(50 μL)，酶標儀測定450 nm處吸光度值，根據標準曲線計算大鼠血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量。

1.2.5 腦組織病理學變化觀察 取4多聚甲醛固定備用腦組織，石蠟包埋，切片4 μm，65℃加熱30 min，脫蠟20 min，蘇木精染色3～5 min、清洗、體積分數1% H2O2浸泡10～30 s，水洗、伊紅染色20 min，水洗，酒精脫水10 min，二甲苯透化10 min，中性樹脂封固，光學顯微鏡觀察。

1.2.6 腦組織TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA檢測 取-80℃存儲備用1/2腦組織，勻漿，Trizol法提取RNA，測定純度、濃度，逆轉錄得cDNA，實時熒光定量PCR反應。反應體系：1.5 μL Taq聚合酶、1 μL上下游引物、4 μL模板cDNA、13.5 μL ddH2O。擴增條件：預變性(95℃，30 s)、變性(95℃，5 s)、退火(59℃，30 s)，共40個循環，加熔解曲線，降溫(50℃，30 s)。以GAPDH作為內源對照，數據分析采用2-△△Ct法，重復多次，取Ct均值。引物序列，見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.7 腦組織TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白檢測 取-80℃存儲備用1/2腦組織，加RIPA裂解緩沖液，離心(6000 r·min-1，10 min，離心半徑20 cm)，取上清，蛋白BCA試劑盒確定總蛋白濃度，將待測蛋白樣品進行電泳分離(100V，80 min)，轉至PVDF膜(250 mA)，用50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h，將樣品與TLR4(1：200)、My D88(1：500)、NF-κB p65(1：1000)、p-NF-κB p65(1：1000)一抗進行孵育(4℃，24 h)，TBST緩沖液洗膜，加二抗室溫孵育(HRP標記IgG，1：5000，2 h)，洗膜，曝光，顯影。Image J軟件測樣品條帶與GAPDH條帶灰度值。目標蛋白相對表達水平計算，即目標條帶與GAPDH條帶灰度比值。

2 結果

2.1 IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平比較 各組血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平組間比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，模型組血清IL-1β、IL-4、TNF-α水平升高，IFN-γ水平降低(P<0.05)；與模型組比較，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽性藥物組血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)；與ISL低劑量組比較，ISL高劑量組、陽性藥物組血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)；與ISL高劑量組比較，陽性藥物組血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平比較Table 2 Comparison of serum IL-1β，IL-4，IFN-γ and TNF-α levels

2.2 腦組織病理學觀察 HE結果顯示，對照組腦組織神經元細胞結構清晰、分布均勻、腦皮質厚度適中，位于中央的核仁大且圓；模型組出現大量腦組織神經元變性、壞死，數量減少，體積縮小，腦皮質厚度變薄，細胞核發生移位、結構模糊，核仁消失。ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽性藥物組腦組織神經元損傷較模型組均出現不同程度改善，其中ISL高劑量組、陽性藥物組改善顯著，神經元細胞數量減少、體積縮小，腦皮質厚度變薄，細胞結構相對較清晰。見圖1。

2.3 TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA水平比較 各組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平組間比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，模型組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽性藥物組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平降低(均P<0.05)；與ISL低劑量組比較，ISL高劑量組、陽性藥物組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平降低，且陽性藥物組低于ISL高劑量組(均P<0.05)。見表3。

表3 腦組織TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA水平比較

2.4 TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平比較 各組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平組間比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，模型組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽性藥物組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低(均P<0.05)；與ISL低劑量組比較，ISL高劑量組、陽性藥物組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低，且陽性藥物組低于ISL高劑量組(均P<0.05)。見圖2、表4。

表4 TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平比較Table 4 Comparison of protein levels of TLR4，My D88，NF-κB p65，and p-NF-κB p65

3 討論

TBI是一種高度異質性損傷，可導致一系列暫時或永久性神經系統改變，其主要病理特征為神經炎癥、氧化應激、興奮性毒性和線粒體功能障礙等[10]。TBI又被認為是一種“雙相損傷”，即原發性損傷和延遲的繼發性損傷。原發損傷是指由機械損傷直接引起的即刻損傷，包括軸突剪切、出血和挫傷，并依據不同損傷嚴重程度分為輕度、中度和重度[11]。而繼發損傷是指由于原發損傷引發病理生理變化進而引起的進一步損傷，包括線粒體功能障礙、氧化損傷和神經炎癥在內的分子過程構成的神經元損傷和退化[12]。TBI病理過程復雜，不僅涉及到外力間接或直接作用引起的損傷，之后繼發的神經元細胞微觀結構的改變，可導致神經元凋亡或死亡，引起神經功能障礙。迄今為止，盡管眾多學者對TBI進行了大量的基礎與臨床研究，但具體作用機制尚不清晰。

神經炎癥是中樞神經系統對損傷反應的主要病理生理特征，包括炎性細胞浸潤、促炎細胞因子表達、小膠質細胞活化等[13]。TNF-α是一種重要炎性介質趨化因子，能夠誘導細胞浸入炎癥局部，進而加重炎癥浸潤導致組織損傷；IL-1β作為一級炎癥細胞因子，能夠促進炎細胞活性[14-15]。IFN-γ、IL-4分別體現Th1、Th2型淋巴細胞主要生物學效應，常被用于細胞免疫功能的檢測指標，一般情況下，機體自身Th1/Th2細胞處于相對平衡狀態，一旦機體免疫功能發生異常，其相對平衡狀態遭到破壞，進而導致Th1/Th2細胞失衡[16]。本研究結果發現，與模型組比較，ISL低、高劑量組大鼠血清IFN-γ水平升高、TNF-α、IL-1β、IL-4水平降低，炎性反應得以改善。HE結果顯示，ISL低、高劑量組腦組織神經損傷較模型組均出現不同程度改善，其中ISL高劑量組腦組織神經損傷改善明顯，與陽性藥物組效果相當，揭示經ISL干預后，Th1/Th2比值升高，Th1/Th2細胞免疫平衡得以修復，能有效抑制相關炎性因子釋放進而減輕炎性反應及組織結構破壞，表明ISL可通過調節Th1/Th2細胞平衡，改善TBI大鼠炎性反應，減輕腦組織損傷。

TLRs屬于跨膜蛋白家族受體，在非特異性或先天免疫防御中起關鍵作用。所有TLR家族成員中，TLR4在小膠質細胞、神經元、星形膠質細胞、內皮細胞等中樞神經系統中廣泛表達[17]。MyD88是TLR4的關鍵銜接蛋白，可激活下游NF-κB因子以及與神經毒性有關的促炎細胞因子。TLR4將細胞內IL-1β同源域激活，通過介導下游信號分子MyD88激活NF-κB效應因子，其中NF-κB易轉位為核磷酸化，調節免疫炎癥因子表達[18]。已有研究[19]證實，經外部刺激后，生物體發起先天性免疫應答，TLR4表達上調，并激活NF-κB通過MyD88的依賴性信號傳導途徑B，從而導致嚴重的異常腸黏膜上皮炎癥。此外，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導促炎細胞因子的釋放并誘導神經元變性和細胞凋亡[20]。Wang等[21]研究證實，在TBI小鼠模型中，雌二醇可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減少神經毒性，減輕神經炎性損傷[21]。Huang等[22]發現，右美托咪定可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕炎癥反應，發揮神經元保護作用。以上研究均表明TLR4在TBI中發揮關鍵作用，本研究結果顯示，ISL能顯著降低TBI大鼠腦組織TLR4、My D88 mRNA和TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白表達，提示ISL可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路關鍵分子表達，減輕炎癥反應以及腦組織損傷，從而降低機體損害風險。

4 結論

ISL可明顯改善TBI大鼠腦組織損傷，通過調控TLR4/MyD88/NF-κB通路相關mRNA和蛋白表達，進而調節下游炎癥因子表達，恢復Th1/Th2細胞免疫平衡，減輕免疫炎性反應，從而發揮腦組織保護作用。本研究可為臨床ISL相關藥物研發及TBI治療提供新的途徑和方法。