非疫苗血清型多重耐藥肺炎鏈球菌的研究現狀及展望

李亞楠，司明輝，張文雙

近年來由于耐藥基因傳播模式及血清型替換導致的群體結構改變，非疫苗血清型（NVT）多重耐藥肺炎鏈球菌（MRSP）的出現在國際公共衛生和臨床環境中引起了極大的關注。肺炎鏈球菌感染至今仍是5歲以下兒童死亡的重要原因，每年達70萬～100萬，其中多數在發展中國家。據WHO報道，盡管至今未出現對萬古霉素耐藥的肺炎鏈球菌，侵襲性感染的病死率仍高達10%～40%[1]。20世紀以來，根據血清型流行概況研制出可覆蓋多種血清型的肺炎鏈球菌結合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine，PCV）：PCV7、PCV10、PCV13等，大大降低了侵襲性肺炎鏈球菌疾病（invasive pneumococcal diseases，IPD）的發生率[2]。2010年PCV13在美國應用后，侵襲性肺炎鏈球菌臨床分離株只有1/4為疫苗覆蓋血清型，大部分感染為NVT，尤其在血液腫瘤等免疫功能低下和膿毒癥的患者。在一項薈萃分析中發現已經將PCV13納入免疫規劃的國家，42.2%的兒童IPD病例由非PCV13血清型引起，尤其是在歐洲和北美，說明NVT的增加在逐漸抵消PCV的作用[3]。但我國的PCV接種并未納入免疫規劃，且肺炎鏈球菌疾病的監測系統尚不完善，僅能了解區域性的流行概況。2020年CHINET細菌耐藥性監測網的結果顯示上海地區兒童患者中分離的耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）菌株中，96.2%對紅霉素耐藥，對克林霉素耐藥率達到92.3%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑全部耐藥，致死率在2007—2015年也在增加。我國對NVT肺炎鏈球菌的耐藥性研究較少，但在國外卻頻頻出現在疫苗接種后由于重組事件等造成的NVT MRSP感染疾病的增加。本文就近5年對NVT MRSP的研究現狀進行綜述及展望，以便為我國血清型流行病學的監測、臨床醫師的經驗性用藥、免疫策略的開發與應用提供參考思路。

1 引入PCV后MRSP血清型流行現狀

1.1 國外MRSP血清型流行現狀

PCV已經被100多個國家納入免疫規劃，在引入后的20年間對菌株血清型及耐藥性監測，發現NVT逐漸占據優勢，成為引入疫苗后的研究熱點，現著重介紹PCV13應用后最常見NVT 11A和15A MRSP菌株的耐藥現狀。

NVT 11A是鼻咽部肺炎鏈球菌分離株最普遍的血清型之一，Baek等[4]發現其在PCV引入后的8年間從3.2%增加到13.2%，在收集到的1 579株肺炎鏈球菌分離株中，發現多重耐藥甚至廣泛耐藥（XDR）的菌株，超過60%的11A菌株對頭孢呋辛、克林霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥，多位點序列分型鑒定出2個主要克隆復合群CC166和CC99，其中多重耐藥克隆群CC166的ST8279、ST9875和ST3598菌株對該研究檢測的所有抗菌藥物均不敏感。

最常見的MRSP NVT為15A-ST63，各個國家的分布不同。見表1。在加拿大觀察到成人肺炎鏈球菌疾病中NVT 22F、15A和8在最流行的血清型排序分別為第1、第5和第7種，全基因組測序發現血清型15A均為多重耐藥菌株[5]；在之前的報道中就已發現該血清型分離株對青霉素、克拉霉素和多西環素具有耐藥性[6]。英國公共衛生部及抗菌化療協會在對抗生素使用的監測中發現NVT 15A在2011年明顯增加，在15A導致的IPD中，分離株中有26%～33%是三重耐藥，即大環內酯類、四環素類和青霉素類耐藥，2013—2015年監測顯示15A是最流行的血清型，其中38%～48%具有三重耐藥性，且幾乎所有的多重耐藥15A菌株經多位點序列分型均屬于ST63[7]。近期在挪威的一項報道中顯示接種PCV13期間，多重耐藥分離株引起的IPD發病率從2004年的0.11/10萬上升到2016年的0.38/10萬，而這種增加 是 由 于NVT 15A （ST63）、24F（ST162）、23B（ST2372）和33F引起，其中血清型15A是多重耐藥IPD增加的主要驅動力，經基因分型后發現幾乎所有的15A多重耐藥分離株均屬于ST63，自2008年以來，該克隆流行率越來越高，覆蓋了多重耐藥分離株的52%[8]；2019年冰島一項對照試驗顯示MRSP菌株自PCV10引入后從34.4%下降至23.9%，87.9%的PRSP菌株是多重耐藥，但在疫苗接種后4年減少到72.9%，NVT多重耐藥菌株 6C、15A卻分別從0.9%、0.9%上升至16.4%、9.1%[9-10]；相似地，保加利亞也報告了NVT 6C和15A同樣的耐藥現況[11-12]。2014年西班牙的一項耐藥監測分析中也顯示與2006年相比，2012年的多重耐藥率增加，主要是由于NVT相關的克隆復合群的出現或增加，如表現為8、15A和19A血清型的CC63、19A/CC320、23A/CC42[13]，提示血清型替換已經成為疫苗接種后的“常駐”現象。

表1 不同國家/地區耐多藥15A-ST63對臨床常用抗菌藥物的耐藥率

2015年Ozawa等[14]在分析PCV7對日本兒童急性中耳炎的影響時，發現NVT 15A造成的高患病率成為難治性中耳炎的重要危險因素，常出現于1歲以下的嬰兒，并成為繼19A之后的第二大血清型，且均為多重耐藥。隨后Naito等[15]也發現血清型6C、15A、15C和19A增加，多藥耐藥克隆在疫苗引入前期（Spain6B-2/ST90、Taiwan19F-14/ST236）下降，而Sweden15A-25/ST63是疫苗后期的優勢克隆。PCV13在2010年引入韓國后，兒童的接種率＞95%，成人接種率約為15%，而在中國，PCV并未納入免疫規劃，接種率不到1%，2019年亞洲一項多中心研究調查顯示韓國和中國MRSP的比例約50.8%，遠高于世界其他地區的報告，如美國的21.8%[16]，特別是19F和19A的分離株中，多重耐藥比例相對較高，在其他研究中發現了15A、15B、35B和23A血清型等也有類似趨勢[17-21]； 2021年韓國在近10年間耐藥監測中也發現，由非PCV13血清型引起的感染以及由NVT MRSP引起的IPD的比例增加，肺炎鏈球菌多重耐藥率在近10年由0.9%上升至25.5%，成為亟待解決的“熱點”問題[22]。

1.2 國內MRSP血清型的流行現狀

我國香港、臺灣是最先將PCV納入“國家免疫計劃”的地區。自2013年引入PCV13，2020年Wu等[23]對PCV引入前后抗生素敏感性進行分析時發現盡管血清型19A在后PCV7/前PCV13期間仍占領主導地位，但NVT 15A和23A已超過19A，成為2018年的前兩個主要血清型，且新出現的血清型15A和23A均為多重耐藥，對β內酰胺類藥物和幾種非β內酰胺類藥物的耐藥性均較高。而我國內地缺乏肺炎鏈球菌的監測機制，非NVT MRSP的研究較少，缺乏相應的數據。

2 NVT肺炎鏈球菌多重耐藥的影響因素

2019年全球肺炎鏈球菌測序計劃啟動后，全基因組測序能夠進一步了解NVT肺炎鏈球菌對抗生素耐藥的機制，如利用基因的重組比來預測抗生素的耐藥性，重組比越高，抗生素耐藥性的平均類別數越高；利用基因組聚集成譜系定義全球肺炎鏈球菌序列簇GPSC并構建抗生素圖，更有助于了解肺炎鏈球菌血清型與耐藥性地理區域傳播的背景[24]。國內對于NVT肺炎鏈球菌流行病學曾有描述，耐藥性卻很少涉及，現根據國內外研究現狀總結如下。

2.1 抗生素的廣泛應用

菌株可通過抗生素的選擇性壓力突變而產生耐藥性[1，25-27]。2003年Ruhe等[28]應用多元logistic分析證實既往抗生素的使用是青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSP）感染的預測因素，此項研究比較全面，在出現感染癥狀前1個月和6個月使用β內酰胺類、磺胺類和大環內酯類抗菌藥物與PNSP菌血癥相關，即短期和長期使用β內酰胺類都可以顯著增加PNSP感染的風險，暴露在不同的抗菌藥物種類及時間的長短均可引起不同程度的抗菌藥物耐藥，成為耐藥性產生的獨立危險因素。肺炎鏈球菌產生耐藥性會造成難治性中耳炎、腦膜炎治療失敗，尤其是NVT MRSP的感染，PCV預防失敗的情況下，最終可能會導致無藥可用的不利境況。有研究報道稱，日本某些地區出現耐美羅培南的多重耐藥菌株15A-ST63，這與當地門診廣泛大量應用廣譜抗生素有關，抗生素的不合理應用可能提供選擇性壓力從而使多重耐藥菌株傳播[29]。在2020年的中國肺炎鏈球菌感染診療及預防共識中，指出血清型可能是肺炎鏈球菌腦膜炎嚴重程度的重要決定因素，尤其在1月齡以上嬰兒及兒童中，不得不考慮在疫苗防治失敗、耐藥菌株存在、萬古霉素滲透腦脊液范圍有限的情況下，如何早期經驗性用藥，以避免延誤治療而導致嚴重的并發癥甚至死亡[1，30]。

2.2 基因的水平轉移

Janoir等[31]分別對PCV7引入后期及PCV13引入后期IPD中分離出的肺炎鏈球菌菌株進行耐藥表型的研究，發現NVT 12F、24F、15A和35B始終與1種或多種抗生素的耐藥性相關，但15A和35B菌株的耐藥率在兩個時期并未發生變化，證明這些NVT的增加可能并不僅僅是由抗生素壓力驅動。肺炎鏈球菌是一種高度重組病原體，可通過攝取和整合來自其他肺炎球菌菌株和其他相關非致病性緩解組物種的DNA而自然轉化。Arushothy等[32]在對1例死于感染的20月齡患者血液標本中分離出的血清型15A-ST1591肺炎鏈球菌菌株的研究中發現，該菌株對紅霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、四環素、氯霉素、青霉素、頭孢曲松和頭孢噻肟均耐藥，該克隆與CC81克隆復合群相關，且在掃描電鏡中觀察到19A（ATCC 700673）和血清型15A（SS40_16）之間可能存在水平基因轉移，這是第一個血清型之間基因轉移的可能性和效果的證據，他們之間共享的脂多糖基質賦予了高抗性的表型特征。日本在2012—2014年對收集的全國兒童NVT 15A的肺炎鏈球菌進行全基因組測序，發現了15A-CC63的新克隆ST9084，該克隆對大環內酯類、青霉素、頭孢噻肟和美羅培南耐藥，原因是在青霉素結合蛋白PBP2x區域發生了重組，導致了額外的頭孢噻肟耐藥，且該類菌株pbp1a、pbp2b和pbp2x的保守氨基酸序列與血清型19A-ST320的相同[33]；另1項葡萄牙的研究使用肺炎鏈球菌定植和感染小鼠模型，結合分離自已接種PCV7的兒童鼻咽部多重耐藥肺炎鏈球菌的全基因組測序結果分析發現，多重耐藥15A-ST63是19F克隆G54的莢膜轉換產物[34]；Nakano等[35]在追溯可以促進美羅培南耐藥的血清型15A-ST63中pbp1a-13序列的來源時發現，44.5%的血清型19A分離株檢測到pbp1a-13，提示19A-CC3111克隆可能是PBP1a的主要存儲庫，pbp1a區可能在不同血清型菌株之間水平轉移，但pbp1a-13單獨存在時可能只導致青霉素耐藥性，pbp2b或pbp2x區域的青霉素結合蛋白（PBP）重組并與pbp1a-13結合導致多重耐藥，再次證明了血清型之間的水平基因轉移可導致多重耐藥。近期Savinova等[36]研究了1種由血清型19A莢膜轉換產生的耐多藥NVT 15A菌株，以血清型15A-ST14599（Sp1994）做參考，進行了全基因組測序及單核苷酸多態性系統發育分析，將不同序列類型的15A與19A基因組進行比較，結果顯示Sp1994與所檢測的19A-ST276基因組親緣關系更相近，表明了二者之間密切的系統發育關系，證明15A分離株在轉換過程中獲得了cps基因座而產生了具有多重耐藥表型的重組體。肺炎鏈球菌的高重組率促進了血清型的轉換及耐藥基因的獲得及傳播，自全球肺炎鏈球菌測序計劃開展以來，英國公共衛生部建議可以利用肺炎鏈球菌全基因組測序來確定血清型與抗生素敏感性的關系[24]，這一舉措有利于觀察菌株血清型轉換的發生及耐藥性的變化，為臨床合理性選擇和用藥提供了指導性意見。

2.3 疫苗的接種

2018年Obolski等[37]通過構建血清型和抗生素耐藥性變化的理論框架，說明了接種疫苗可以消除疫苗血清型與NVT的競爭，從而導致先前存在的NVT耐藥變異體的頻率快速增加，即耐藥性增加。因此避免PCV對肺炎鏈球菌血清型的選擇壓力顯得至關重要，但由于目前PCV對耐藥性的研究有限，仍需進一步深究。

3 結語與展望

綜上所述，肺炎鏈球菌感染仍是一個重大的公共衛生危害。盡管隨著地域不同，受到PCV的影響不同，但引入疫苗后NVT MRSP菌株的傳播逐漸成為一種流行趨勢，目前的疫苗仍是以肺炎鏈球菌莢膜多糖為抗原，成本較高且血清型覆蓋類型有限，因此需要開發新的持久保護、適應性更強、成本更低的防治策略。近年來隨著基因組技術的發展，肺炎鏈球菌毒力因子的研究成為熱點，以此作為基礎研發獨立于血清型的疫苗層出不窮，如利用肺炎鏈球菌TIGR4裂解液制備的多抗原疫苗（MAV）[38]，全細胞肺炎鏈球菌疫苗（WCV）[39]，PspA重組抗原疫苗[40]等；在治療方面，Liakopoulos等[41]用棋盤法和紙片擴散法藥敏試驗證實了Mn復合物[Mn（CO）3（tpa-κ3N）]Br對臨床相關肺炎鏈球菌具有體內外抗菌活性，并有可能與現有抗生素聯合使用，提高對MRSP的有效性，但均缺乏臨床試驗。因此，針對肺炎鏈球菌疫苗后血清型轉換及多重耐藥等諸多問題需給予高度重視，預防及治療肺炎鏈球菌感染有待開拓新思路。