小鼠炎癥性腸病合并艱難梭菌感染模型的建立與評價

王 莉，周芬芬，胥 騰，吳 湜，李靜文，黃海輝

艱難梭菌是引起醫(yī)院獲得性腹瀉的重要病原體，也是炎癥性腸?。↖BD）加重或反復(fù)的危險因素。多項研究顯示IBD亦是艱難梭菌感染（CDI）的一項獨立危險因素[1]。近年來，IBD合并CDI的發(fā)病率上升，病情嚴重，急性結(jié)腸切除率和死亡率均增高[2-3]。然而，IBD患者合并CDI發(fā)病機制尚不明確，構(gòu)建能反映疾病特點的動物模型對進一步研究十分必要。

最初國外研究者采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，繼而腹腔注射克林霉素以誘導(dǎo)CDI來建立IBD急性期合并CDI模型[4]。由于部分IBD患者是在緩解期出現(xiàn)CDI[5-6]，因而又有研究者先通過給予小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，之后小鼠度過一段恢復(fù)期，然后再給小鼠飲用抗生素混合液及腹腔注射克林霉素以誘導(dǎo)CDI來建立IBD合并CDI模型[5]。然而由于頭孢哌酮抗菌譜廣，安全性好，因此近年來臨床上IBD患者應(yīng)用克林霉素的機率遠低于頭孢哌酮，既往很多動物研究也顯示頭孢哌酮的干預(yù)有利于艱難梭菌的定植[7-9]。但是頭孢哌酮腹腔注射給藥對誘導(dǎo)小鼠艱難梭菌定植特點未見報道，為此，本研究擬分別采用腹腔注射克林霉素或頭孢哌酮誘導(dǎo)CDI，以探索建立更符合臨床過程的IBD急性期和恢復(fù)期小鼠合并CDI模型的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株和細胞 艱難梭菌菌株SW2007H1（核糖體型027菌株），由瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院惠贈。Vero 細胞（目錄號：SCSP-520）購自中國科學院細胞庫，用于糞便毒素檢測實驗。

1.1.2 實驗動物 野生型C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，16～19 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國科學院上海巴斯德研究所ASBL2動物房。所有實驗與操作均符合動物倫理規(guī)范與要求（倫理批號：2020069）。

1.1.3 抗菌藥物 克林霉素、頭孢哌酮等抗菌藥物均購于大連美侖生物科技有限公司。抗菌藥物混合液由45 mg/L萬古霉素、35 mg/L黏菌素、 35 mg/L慶大霉素和215 mg/L甲硝唑溶于無菌水中，0.22 μm過濾后備用。

1.1.4 主要試劑和培養(yǎng)基 DSS為美國MP Biomedicals公司產(chǎn)品。心腦浸液瓊脂及肉湯、酵母提取物為英國OXOID公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 艱難梭菌芽孢制備 將1株艱難梭菌（核糖核酸型027）從－80℃冰箱取出，接種于含添加劑的心腦浸液（BHIS）平板上，厭氧培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落至BHIS肉湯中，過夜增菌，將菌液涂布于BHIS平板上。厭氧培養(yǎng)約1周后，顯微鏡下觀察菌體全部變?yōu)檠挎吆螅? 000 r/min離心10 min，留取沉淀，用無菌PBS洗滌2～3次，用PBS重懸，65℃加熱30 min以殺死營養(yǎng)細胞。將菌液10倍系列稀釋涂布于BHIS平板上，進行芽孢計數(shù)，制備106CFU/mL的芽孢懸液，4℃保存。

1.2.2 模型建立與分組 將小鼠分為IBD急性期合并CDI和IBD恢復(fù)期合并CDI 2大組，每個大組再根據(jù)腹腔注射克林霉素或頭孢哌酮分為2小組，共4組，每組8只鼠，另設(shè)1組健康對照組，不作任何處理。所有時間計算都以24 h計。IBD急性期合并CDI組先給予3%DSS飲用水5 d（Day0～Day5），后換成正常飲用水，于第6天分別腹腔注射1劑10 mg/kg克林霉素或100 mg/kg頭孢哌酮，于第7天每只小鼠灌胃105CFU艱難梭菌芽孢（即100 μL 含 106CFU/mL芽孢PBS混懸液）；IBD恢復(fù)期合并CDI組先給予2%DSS飲用水6 d （Day0～Day6），后換成正常飲用水15 d，再給抗生素混合液3 d（Day21～Day24），再改為正常飲用水，于第26天分別腹腔注射1劑10 mg/kg 克林霉素或100 mg/kg頭孢哌酮，于第27天每只小鼠灌胃105CFU艱難梭菌芽孢（即100 μL 含 106CFU/mL芽孢PBS混懸液）。上述各組小鼠均觀察至第34天，小鼠處于瀕死狀態(tài)將被處死[4]，感染組實驗設(shè)計見圖1。

1.2.3 觀察指標 ①小鼠的體重變化。②小鼠疾病活動度指數(shù)（disease activity index，DAI）評分[4]：根據(jù)體重，將下降＜5%、5%～10%、11%～15%、16%～20%、＞20%依次評為0、1、2、3、4分；糞便性狀為成形、柔軟、腹瀉、中度腹瀉和全腹瀉，分別評為0、1、2、3、4分；根據(jù)便血程度評分，無便血為0分，微紅色為2分，血便為3分，全血便為4分；總分為12分。③小鼠生存率：體重下降＞初始體重20%認定為瀕死狀態(tài)，將被處死，與實際死亡的小鼠共同計算死亡率。④病理觀察：小鼠疾病高峰期時取結(jié)腸做病理分析，采用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色。根據(jù)炎癥程度、隱窩破壞和潰瘍情況3方面評分，共11分[4]。

1.2.4 檢測糞便中細胞毒素 給予艱難梭菌灌胃48 h后（Day2或Day3），收集小鼠糞便。將收集的小鼠糞便或腸道內(nèi)容物樣本溶于10倍質(zhì)量體積的無菌PBS中混勻后，4℃ 15 000 r/min 離心 5 min，取上清液作系列稀釋，加入至單層Vero細胞中，放置在5% CO2孵箱中，37℃培養(yǎng)，觀察若超過80%細胞變圓則為毒素陽性[10]。若糞便毒素陽性且小鼠出現(xiàn)相應(yīng)艱難梭菌感染癥狀，如弓背、體重下降、腹瀉等癥狀，則表明感染成功。

1.2.5 菌株鑒定 糞便樣本采用Cepheid公司的Xpert?C. difficileAssay 艱難梭菌核酸檢測試劑盒驗證是否為tcdC基因突變艱難梭菌，如檢測陽性則提示致病菌為027型可能大。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad 8.0進行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立小鼠IBD合并CDI模型

4組小鼠均出現(xiàn)腹瀉和體重下降癥狀，同時糞便毒素檢測陽性，糞便艱難梭菌tcdC突變陽性，病理顯示結(jié)腸出現(xiàn)炎性滲出、隱窩破壞和局灶潰瘍，因此建模成功。

2.2 小鼠體重變化和DAI評分

2.2.1 急性期組 在感染艱難梭菌后，克林霉素組和頭孢哌酮組小鼠均出現(xiàn)體重下降，其中克林霉素組在感染艱難梭菌第3天體重下降最嚴重，后呈回升趨勢，頭孢哌酮組主要在第1、2天體重下降，后迅速恢復(fù)?？肆置顾亟M體重下降程度較頭孢哌酮組更為明顯，體重回升相對較慢。克林霉素組小鼠DAI評分在感染后第3天最高，頭孢哌酮組在第1、2天較高，感染后克林霉素組小鼠DAI評分均高于頭孢哌酮組，自第3天起兩組DAI評分差異有統(tǒng)計學意義，見圖2A、2B。

2.2.2 恢復(fù)期組 在感染前，因給小鼠飲用DSS水溶液誘導(dǎo)輕中度腹瀉，小鼠于第8、9天體重下降最為明顯，后逐漸回升至正常水平，克林霉素組和頭孢哌酮組體重變化相似。在感染后，克林霉素組體重逐漸下降，至第3天下降至最低并全部死亡，頭孢哌酮組于第1、2天下降明顯但程度較輕，第3天迅速回升?？肆置顾亟M體重下降程度較頭孢哌酮組更為明顯?？肆置顾亟MDAI評分較頭孢哌酮組為高，在第2、3天差異有統(tǒng)計學意義，頭孢哌酮組DAI評分于第4天降低至近0，見圖2C和2D。

2.3 小鼠生存率

2.3.1 急性期組 克林霉素組小鼠生存率為25.0%（2/8），死亡主要集中在艱難梭菌芽孢感染后第2、3天，與對照組生存率有顯著差異。頭孢哌酮組小鼠生存率為62.5%（5/8），死亡主要集中在感染后第1、2天，但與對照組差異無統(tǒng)計學意義，見圖3A。

2.3.2 恢復(fù)期組 在感染后，克林霉素組小鼠在第2、3天相繼全部死亡。頭孢哌酮組小鼠只在第2天出現(xiàn)1只死亡，生存率為87.5%（7/8），生存率明顯高于克林霉素組，差異顯著，但與對照組差異無統(tǒng)計學意義，見圖3B。

2.4 小鼠組織病理學變化

與健康對照組相比，4組感染組小鼠結(jié)腸均出現(xiàn)不同程度的炎性滲出。急性期克林霉素組出現(xiàn)炎性細胞向黏膜下層浸潤，隱窩破壞嚴重，并出現(xiàn)潰瘍，而急性期頭孢哌酮組炎性浸潤和隱窩破壞較前者為輕?；謴?fù)期克林霉素組也同樣出現(xiàn)了炎性細胞的廣泛浸潤，隱窩破壞嚴重甚至消失，伴有局灶性潰瘍，而恢復(fù)期頭孢哌酮組病理改變相對輕微。與健康對照組相比，急性期克林霉素組和頭孢哌酮組組織評分分別為7.33±0.29和5.33±2.02，恢復(fù)期克林霉素組和頭孢哌酮組評分分別為7.67±0.29和4.67±1.61，4組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

IBD被認為是由多種因素引起的黏膜免疫反應(yīng)紊亂和腸道菌群失調(diào)的一種慢性腸道炎癥。艱難梭菌在宿主菌群受到破壞的情況下，產(chǎn)毒素菌株通過分泌毒素破壞腸道屏障，引起以腹瀉為主的一系列癥狀[11]。IBD患者對艱難梭菌的易感與IBD病情嚴重程度有關(guān)[12]。因而建立不同疾病階段的IBD合并CDI動物模型是研究二者相互作用及機制的重要平臺，為探索新的防治方案提供 參考。

很多研究采用腹腔注射克林霉素的方法建立CDI動物模型[13-14]。Tomkovich等[15]的研究顯示克林霉素干預(yù)后，小鼠的腸道菌群發(fā)生明顯變化，比如毛螺菌科、瘤胃菌科、腸桿菌科細菌豐度改變，艱難梭菌易定植。同時，也有研究通過給予小鼠飲用頭孢哌酮水溶液成功誘導(dǎo)CDI[8]。Theriot等[7]的研究顯示小鼠飲用頭孢哌酮水溶液后，腸道微生物組和代謝組也發(fā)生了明顯的變化，比如擬桿菌科細菌明顯減少，變形菌門細菌明顯增多；代謝物初級膽汁酸、糖醇增多，次級膽汁酸、葡萄糖、游離脂肪酸減少，為艱難梭菌易感狀態(tài)。此外，有研究對比了抗生素雞尾酒療法聯(lián)合腹腔注射克林霉素、頭孢哌酮水溶液飲用5 d和10 d 3種不同抗生素給藥方法誘導(dǎo)CDI，均成功建立了CDI模型[10]。但上述方法頭孢哌酮的干預(yù)方式均為配制成水溶液供小鼠自由飲用數(shù)日，但未見頭孢哌酮腹腔注射對小鼠艱難梭菌定植的影響。近年Zhou等[4]的研究首次發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠感染艱難梭菌時，臨床結(jié)局較IBD和CDI單病種小鼠更差，同時IBD小鼠在有抗生素使用史的情況下，腹腔注射克林霉素后更易感染艱難梭菌。本研究對比了IBD急性期小鼠分別腹腔注射克林霉素和頭孢哌酮后的相關(guān)表型，發(fā)現(xiàn)克林霉素誘導(dǎo)CDI的小鼠疾病嚴重程度較頭孢哌酮組為重，且恢復(fù)相對較慢，更符合IBD合并CDI疾病較重的特點，也與Zhou等[4]的研究一致。Saleh等[5]研究在DSS撤去15 d后，再對小鼠按照建立CDI模型的方法給藥，該模型可更好反映臨床上IBD患者緩解期的表現(xiàn)。本研究同樣對比了IBD恢復(fù)期小鼠分別注射克林霉素和頭孢哌酮對誘導(dǎo)CDI的影響，結(jié)果顯示克林霉素誘導(dǎo)的小鼠疾病較重，死亡率100%，與Saleh等[5]的研究一致，而頭孢哌酮誘導(dǎo)的小鼠病情輕微，可能無法模擬IBD合并CDI患者情況。本研究發(fā)現(xiàn)IBD急性期和恢復(fù)期的小鼠感染艱難梭菌后，疾病變化過程類似，如急性期和恢復(fù)期IBD小鼠采用克林霉素誘導(dǎo)合并CDI時，在感染艱難梭菌后第3天疾病最為嚴重。不同的是，克林霉素誘導(dǎo)的恢復(fù)期組模型較急性期組病情更為嚴重，生存率更低，有研究認為這可能是結(jié)腸炎誘導(dǎo)產(chǎn)生T輔助17細胞，這些細胞在結(jié)腸炎恢復(fù)后仍存在于腸系膜淋巴結(jié)中，并在之后CDI時發(fā)揮作用，加重病情[5]。

本研究存在一定局限性：采用化學法DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，只能模擬IBD中潰瘍性結(jié)腸炎的疾病特點，不適用于克羅恩病[16]；未對不同模型小鼠腸道菌群及代謝產(chǎn)物進一步分析，做機制上的 探索。

綜上所述，相較于頭孢哌酮，采用腹腔注射克林霉素的方法建立IBD急性期和恢復(fù)期小鼠合并CDI模型更為嚴重，生存率更低，因而推薦采用10 mg/kg的克林霉素腹腔注射誘導(dǎo)建立急性期或恢復(fù)期IBD小鼠感染艱難梭菌的模型，可反映臨床上處于不同階段的IBD合并CDI患者的特點。