ICU血流感染患者碳青霉烯類抗菌藥物耐藥肺炎克雷伯菌的毒力和耐藥基因分布及其與感染嚴(yán)重程度的相關(guān)性

祁晶晶，楊雨陽(yáng)，馬秀敏，宮海燕，單驕宇

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊 830011)

隨著廣譜抗菌藥物應(yīng)用的普及，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻，特別是對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達(dá)32.8%[1]，死亡率明顯高于非耐藥菌株[2]。近年來，KPN的新變種——高毒力KPN(hyper virulent KPN，hvKP)以高致病性、高檢出率和高傳播性為特點(diǎn)，引起人們的關(guān)注。與普通KPN不同，hvKP原發(fā)病灶形成后，可在短時(shí)間內(nèi)引起血流播散性感染，且極易導(dǎo)致院內(nèi)暴發(fā)流行[3]。研究表明，KPN毒力強(qiáng)弱主要與其攜帶的毒力基因有關(guān)，這些基因?qū)PN的黏附性和侵襲性等產(chǎn)生影響，從而使患者感染KPN后，在感染嚴(yán)重程度和預(yù)后方面存在差異[4]。但目前關(guān)于hvKP的研究多集中于毒力基因的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，其與患者感染嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究擬探討耐碳青霉烯類KPN(carbapenem-resistant KPN，CR-KP)血流感染患者中高毒力CR-KP(carbapenem-resistant hyper virulent KPN，CR-hvKP)毒力基因的流行病學(xué)特點(diǎn)，并分析毒力基因與感染嚴(yán)重程度的相關(guān)性，以期為患者臨床治療和預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年1月至2020年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科首次分離的180株非重復(fù)CR-KP，以上菌株來自180例重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)血流感染患者的血液樣本(多次標(biāo)本送檢者以第一次檢查結(jié)果為準(zhǔn))。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者血流感染臨床診斷明確，所有經(jīng)血液分離的CR-KP菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定；②患者年齡≥18周歲，男女不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他細(xì)菌引起的感染；②無(wú)法獲得膿毒癥相關(guān)序貫器官衰竭(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)評(píng)分。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(倫理批準(zhǔn)號(hào)：XYDWFYLSH-2019-012)。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司)對(duì)分離的CR-KP進(jìn)行鑒定并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照由美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)制訂的2017年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[5]。其中，CR-KP菌株定義為KPN對(duì)美羅培南或亞胺培南任一種碳青霉烯類抗菌藥物最低抑菌濃度≥4 mg/L。對(duì)所有分離的CR-KP菌株進(jìn)一步行拉絲試驗(yàn)，即使用接種環(huán)在培養(yǎng)皿上挑起經(jīng)24 h培養(yǎng)的CR-KP菌落，重復(fù)牽拉2次，若每次長(zhǎng)度均≥5 mm，則鑒定為CR-hvKP。

1.3碳青霉烯酶耐藥基因、血清莢膜分型及毒力基因檢測(cè)

1.3.1DNA模板制備 用接種環(huán)從培養(yǎng)皿中挑取適量菌落至1.5 ml EP管，加入滅菌去離子水300 μl后震蕩混勻，并以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心5 min，用移液槍棄去上清液。向離心所得的沉淀物中再次加入300 μl滅菌去離子水，震蕩混勻，于100 ℃煮沸15 min后，以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，抽取上清液即為DNA模板。

1.3.2引物設(shè)計(jì) 參考Antony等[6]的研究設(shè)計(jì)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)、新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)、苯唑西林酶-48型(oxacillinaase-48，OXA-48)和金屬β-內(nèi)酰胺酶(verona integron-mediated，VIM)4種碳青霉烯酶耐藥基因引物序列。參考El-Mahdy等[7]和Xu等[8]研究分別設(shè)計(jì)K1、K2、K5、K20、K54和K57 6種莢膜血清分型引物和rmpA、iutA、rmpA2、magA、allS、wcaG、aerobactin、ybtS、entB、kfu9 10種常見毒力基因引物。各引物相關(guān)信息見表1。

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 聚合酶鏈反應(yīng)體系25 μl，其中包括DNA模板、引物正向引物和引物反向引物各1 μl，Taq PCR Master Mix 12.5 μl，雙蒸水9.5 μl。聚合酶鏈反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，退火30 s(根據(jù)產(chǎn)物大小略有不同)，72 ℃ 延伸60 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸7 min。

1.3.4電泳 取5 μl聚合酶鏈擴(kuò)增產(chǎn)物并將其加入2.0%瓊脂糖凝膠上樣孔，分別將電壓和電流設(shè)定為180 V和200 mA，電泳30 min后于紫外燈檢測(cè)儀下觀察結(jié)果，并進(jìn)行攝像保存結(jié)果。

表1 各基因聚合酶鏈反應(yīng)引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

2 結(jié) 果

納入本研究的180株CR-KP宿主中男116例、女64例，年齡51～78歲，平均(64±11)歲；合并糖尿病43例，合并高血壓46例；治療過程中接受氣管插管患者105例，患者均聯(lián)合使用2種或2種以上抗菌藥物，以碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑為主。其中CR-hvKP感染患者62例(34.4%)。

2.1CR-KP血流感染患者的臨床特征分析 CR-hvKP組患者年齡、合并糖尿病及30 d內(nèi)死亡比例明顯高于CR-non-hvKP組(P<0.05)，兩組性別、合并高血壓、醫(yī)源性侵襲操作、抗菌藥物暴露情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 CR-hvKP組與CR-non-hvKP組血流感染患者臨床特征比較

2.2CR-KP菌株耐藥基因檢測(cè) 180株CR-KP菌株中檢出攜帶KPC基因172株，攜帶NDM基因8株，未檢出OXA-48和VIM基因。其中攜帶KPC基因的菌株在CR-hvKP組和CR-non-hvKP組分別有61株(98.4%)和110株(93.2%)，攜帶NDM基因的菌株在CR-hvKP組和CR-non-hvKP分別有1株(1.6%)和7株(5.9%)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.284，P=0.131；χ2=1.785，P=0.181)。

2.3CR-KP血清莢膜分型和毒力基因 本研究中僅檢出3株K2血清夾膜分型，均來自CR-hvKP菌株，其余CR-KP未獲得血清夾膜分型。ICU血流感染患者CR-KP菌株攜帶的毒力基因以ybtS(95.6%)和entB(81.7%)為主，其中CR-hvKP組菌株中攜帶rmpA、iutA和rmpA2毒力基因的比例高于CR-non-hvKP組(P<0.05)，CR-hvKP與CR-non-hvKP組其余毒力基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 180株毒力基因檢出情況及在CR-hvKP組和CR-non-hvKP組的分布

2.4毒力基因與SOFA評(píng)分的相關(guān)性 180株CR-KP宿主SOFA評(píng)分3～15分，平均(8.1±3.0)分。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，毒力基因rmpA、iutA和rmpA2與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.001)，與其他毒力基因無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

3 討 論

隨著我國(guó)碳青霉烯類抗菌藥物應(yīng)用的不斷增加，CR-KP的檢出率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，由CR-KP導(dǎo)致的感染已成為目前抗感染治療的棘手問題。近年來，不斷有碳青霉烯類抗菌藥物耐藥hvKP流行的臨床報(bào)道[3，9]，該類菌株不僅表現(xiàn)出對(duì)多種碳青霉烯類

表4 180株CR-KP宿主毒力基因與SOFA評(píng)分的相關(guān)性

抗菌藥物耐藥的特點(diǎn)，同時(shí)相較于非高毒力CR-KP，侵襲能力更強(qiáng)、播散范圍更廣、致死率更高，對(duì)患者生命健康造成了極大威脅，成為目前臨床抗感染治療領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，目前關(guān)于CR-hvKP感染患者毒力基因分布特征及其與感染嚴(yán)重程度關(guān)系的報(bào)道非常有限。

大量研究證實(shí)，高齡、合并多種基礎(chǔ)疾病、碳青霉烯類抗菌藥物暴露史及醫(yī)療侵襲性操作是CR-KP感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-11]。本研究以ICU患者作為研究對(duì)象，該類患者往往合并多種基礎(chǔ)疾病，治療過程中侵襲性操作較多，且抗菌藥物的暴露明顯高于非ICU，是醫(yī)療機(jī)構(gòu)中CR-KP流行的重點(diǎn)區(qū)域。結(jié)果顯示，CR-hvKP組的年齡、合并糖尿病及患者30 d內(nèi)死亡比例明顯高于CR-non-hvKP組(P<0.05)。提示高齡和糖尿病是hvKPN感染的重要誘發(fā)因素，該類患者往往病程進(jìn)展較快，死亡率更高。

本研究中所檢出的ICU血流感染患者致病菌CR-KP均為多重耐藥細(xì)菌。產(chǎn)碳青霉烯酶是碳青霉烯類抗菌藥物對(duì)KPN耐藥的最常見耐藥機(jī)制[12]。其中，KPC型是目前較為關(guān)注的碳青霉烯酶。本研究180株CR-KP中，攜帶KPC基因的菌株達(dá)到95.0%(171/180)，提示產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶可能是ICU血流感染患者CR-KP耐藥的主要機(jī)制。然而，本研究中也發(fā)現(xiàn)8株攜帶NDM基因的CR-KP。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)NDM的CR-KP呈上升趨勢(shì)，且在治療藥物的選擇上與產(chǎn)KPC的CR-KP也存在明顯不同[13-14]，因此應(yīng)引起臨床醫(yī)師的重視。

現(xiàn)有研究證實(shí)，CR-KP的致病能力主要通過莢膜多糖、高黏液型及鐵攝取等毒力因子實(shí)現(xiàn)[15]。其中，莢膜是一種覆蓋于細(xì)菌細(xì)胞壁表面的多糖物質(zhì)，具有顯著的抗宿主殺傷作用，可規(guī)避免疫細(xì)胞的吞噬作用，目前被認(rèn)為是CR-KP最重要的毒力因子之一。常見的高毒力KPN莢膜分型包括K1、K2、K5、K20、K54和K57[16]，而本研究中僅在CR-hvKP菌株中發(fā)現(xiàn)3株攜帶K2抗原的菌株，其他菌株均未獲得常見的抗原分型，其原因可能是CR-KP在獲得耐藥基因的同時(shí)莢膜的表達(dá)出現(xiàn)下降或出現(xiàn)了其他莢膜分型的表達(dá)，導(dǎo)致常見莢膜分型無(wú)法檢測(cè)。本研究結(jié)果還顯示，毒力基因rmpA、rmpA2和iutA與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.01)，提示攜帶這些基因的CR-KP感染患者的病情更嚴(yán)重，預(yù)后更差。rmpA和rmpA2是黏液表型的重要調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)細(xì)菌表面保護(hù)性生物膜的形成，且兩者均可參與自身代謝，具有高度的同源性[17]，而氣桿菌素iutA則是鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因，可與rmpA和rmpA2共同作用、相互影響，增加細(xì)菌的繁殖能力和黏附性，加速細(xì)菌的播散，從而加重感染情況[18]。杜芳玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ICU血流感染患者中，CR-KP菌株攜帶rmpA、rmpA2和iutA基因的患者死亡率更高，提示其感染可能更加嚴(yán)重。而郝超國(guó)等[20]分析哮喘合并KPN肺部感染患者疾病嚴(yán)重程度與毒力基因的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，攜帶rmpA和rmpA2基因的KPN肺部感染患者病情更嚴(yán)重。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，ICU中CR-KP血流感染患者菌株主要以產(chǎn)KPC為主，且攜帶多種毒力基因，其中rmpA、rmpA2和iutA基因與疾病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，攜帶上述基因的CR-hvKP感染患者的死亡率較高。臨床中應(yīng)注重ICU細(xì)菌流行病學(xué)的調(diào)查研究，增強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員對(duì)CR-KP的認(rèn)識(shí)，以減少醫(yī)院獲得性感染的發(fā)生。