響應面法優化超聲協同ZnO NPs處理對鮮切萵筍的保鮮效果

徐為雯，王順民，羅 麗，王思蒙，彭文蘋

(安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000)

鮮切食品具有方便、多樣的特點，可以滿足人們日益快節奏的生活方式[1]。例如萵筍常被切割成不同的切塊進行市場售賣，即食的鮮切萵筍因其酥脆的口感和獨特的香氣在火鍋中非常受青睞[2]。但隨著市場的擴大，鮮切食品的保存也成為其中關鍵問題。鮮切食品貯藏過程中最常見和最嚴重的問題是組織褐變。其次鮮切食品在采后的處理和加工過程中更易受微生物感染，導致其貨架壽命短，質量差[3]。加工新鮮萵筍的操作，如切割和干燥，都會使其組織損傷，導致質量迅速惡化和保質期縮短[4]。因此，降低鮮切萵筍質量損失，從而延長其保質期是有意義的[5]。

超聲波作為一種新穎、安全的技術，被廣泛應用于食品加工和儲藏[6-9]。頻率高于16 kHz的高功率超聲波具有機械、化學和生化效應，可用于改變不同食物系統的理化性質[10]。當超聲通過生物結構傳播時，會引起介質粒子的壓縮和凹陷，發生許多物理、化學和生化效應并產生大量的能量，這使得超聲的各種應用成為可能。在食品工業中，超聲波的使用不僅可以清潔食物表面，還能殺死細菌，滅活病毒[11]。研究表明，經超聲處理的番茄能保持良好的貯藏品質[12]，超聲處理過的梅子細菌計數減少了0.42～1.47 logCFU/g[13]。超聲波也常常被用于保存鮮切食品[3]。雖然超聲處理有利于減少微生物，延長鮮切食品的保質期，但僅用超聲處理效果有限。研究表明超聲與其他方法相結合是一種加強鮮切食品保鮮效果的更高效方法[14]。因此，鮮切產業已嘗試用超聲與其他保鮮方法，如有機酸、精油、臭氧或消毒劑相結合，以提高保鮮效果[3]。人們也正在尋找更加新穎的材料或技術與超聲相結合來加強保鮮效果[15]。

近年來，功能性金屬氧化物經美國食品藥品管理局(21CFR182.8991)批準已被用于改善薄膜的力學和抗菌特性[16]。其中納米氧化鋅(ZnO NPs)由于其低毒性作為鋅補充劑和抗菌劑被廣泛應用于食品工業中，以延長果蔬的貯藏時間[17-21]。ZnO NPs能夠作為抗菌劑使用，一是由于ZnO NPs表面與水反應產生羥基自由基(OH)或過氧化氫，二是ZnO NPs可以在紫外區域獲得光子能量，形成電子和空穴對，進一步與水和氧氣反應產生活性氧進行殺菌[22]。ZnO NPs在作為抗菌劑時甚至很少表現出介導的細菌耐藥性和低細胞毒性[23]。

目前關于超聲波、ZnO NPs溶液單獨對鮮切萵筍保鮮效果影響的報道較多，但是超聲協同ZnO NPs處理對鮮切萵筍保鮮效果影響的報道相對較少。本研究采用超聲波、ZnO NPs溶液對鮮切萵筍分別進行單因素保鮮處理，再利用響應面試驗對超聲協同ZnO NPs進行條件優化，探索上述方法對鮮切萵筍保鮮效果及品質指標的影響，從而為進一步提高鮮切萵筍的保鮮效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試紫葉“金農”萵筍購自蕪湖鏡湖區新城中心蔬菜市場。選取大小均一、表面無機械損傷、內部無空心、無病蟲害的新鮮萵筍,采購后立即運回實驗室。丙酮、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；ZnO NPs(Merk-aldrich化學試劑公司)。

1.2 主要儀器與設備

手持式精密色差儀(CHINSPEC，中國彩譜儀器有限公司)；液晶超聲波清洗器(KS-100DE，昆山潔力美超聲儀器有限公司)；可見分光光度計(L3S，上海儀電分析儀器有限公司)；電子天平(JY1002，上海精密科學儀器有限公司)；醫用離心機(TGL-16A，長沙平凡儀器儀表有限公司)。

1.3 試驗方法

(1)材料處理。將挑選好的萵筍隨機分為6組，去葉清洗后晾干去皮，切成片狀(厚度為0.4 cm)分別用蒸餾水及不同條件的5個因素水平浸泡處理10 min，晾干后分裝于8 cm×12 cm×5 cm聚乙烯(PE)一次性密封塑料袋中，每袋約10 g，置于4 ℃、相對濕度為45%～75%條件下冷藏。

(2)單因素試驗。①前期處理好的鮮切萵筍分別在超聲功率為100、200、300、400、500 W，超聲溫度為45 ℃條件下，超聲處理10 min；②前期處理好的鮮切萵筍分別在超聲溫度為25、35、45、55、65 ℃，超聲功率為300 W條件下，超聲處理10 min；③前期處理好的鮮切萵筍在超聲功率300 W和超聲溫度45 ℃條件下，分別超聲處理3、5、10、15、20 min；④前期處理好的鮮切萵筍分別在ZnO NPs溶液濃度為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/L條件下浸泡10 min；分別于貯藏0、2、4、6、8 d時取樣測定鮮切萵筍的4個品質測定指標(失重率、感官評價、a*值和葉綠素含量)，研究每個因素對鮮切萵筍保鮮效果的影響。本研究中每個處理組和對照組均重復3次。

(3)響應面試驗。根據Box-Behnken響應面設計原理，以超聲功率、超聲時間、超聲溫度和ZnO NPs溶液濃度為4個變量，分別以鮮切萵筍的失重率、a*值和葉綠素含量作為響應值進行4因素3水平的中心組合試驗，利用Design Expert 8.0.6軟件分析數據，確定超聲協同ZnO NPs保鮮方法的最佳工藝條件。響應面分析因素與水平設計如表1所示。

表1 Box-Behnken設計因素及水平表

(4)失重率的測定。失重率的測定采用差量法，分別記錄各因素處理的樣品第0、2、4、6、8 d的重量，用式(1)計算處理樣品的失重率。

(1)

式中,M1為貯藏前重量；M2為貯藏后對應天數重量。

(5)感官評價的測定。參照王羽等[24]的研究，稍作修改。選取經過培訓的10名食品專業本科生依據鮮切萵筍感官評價標準(見表2)對鮮切萵筍橫切面的色澤、氣味、硬度和品質進行綜合感官評價。

(6)a*值的測定。采用色差儀測定a*值。選取鮮切萵筍樣品橫切面任意面積測定，重復3次，其中a*值正、負值分別表示偏紅和偏綠。

(7)葉綠素含量的測定。參考余翔等[25]的方法，并稍做修改。稱取0.2 g鮮切萵筍樣品，放入盛有10 mL提取溶劑[V(80%丙酮)∶V(95%乙醇)=2∶1]的容量瓶中，封口，置于黑暗條件下浸提至萵筍呈無色時過濾出萵筍樣品，用提取溶劑定容至25 mL后，于645 nm和663 nm波長處測定吸光度。將吸光度帶入式(2)、(3)中計算葉綠素含量。

Ct=8.02A663 nm+20.01A645 nm,

(2)

(3)

式中,Ct為分光光度法計算出的葉綠素質量濃度(mg/L)；V為提取液體積(mL)；m為樣品質量(g)。

表2 鮮切萵筍感官評價標準

1.4 數據處理

采用Sigmaplot 14.0作圖，實驗結果取3次測定平均值，利用SPSS 19.0軟件對數據進行差異顯著性檢驗、回歸分析及相關性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

(1)超聲功率對鮮切萵筍保鮮效果的影響。超聲功率對鮮切萵筍品質指標的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著超聲波功率的增加，鮮切萵筍的失重率和a*值隨功率的增加呈先下降后上升的趨勢，不同的超聲功率處理組失重率均呈顯著性差異(P<0.05)，而鮮切萵筍的感官評價和葉綠素含量則隨著功率的增加呈先上升后下降趨勢。第8 d時，300 W超聲功率處理下的鮮切萵筍失重率最低，為(1.362±0.255)%，比對照組降低了36.77%。當超聲功率大于300 W后，鮮切萵筍失重率反而比對照組更高。原因可能是隨著超聲功率增大，破壞了果蔬中部分水分子和水分子之間的氫鍵，從而加速了水分的流失[26]。相應的，300 W超聲功率處理下的鮮切萵筍感官評價最高，葉綠素含量最高，a*值相較于其他處理組別也最好。因此，根據單因素實驗結果結合實際生產的經濟性，選擇超聲功率為200、300、400 W進行響應面優化試驗為宜。

(2)超聲時間對鮮切萵筍保鮮效果的影響。超聲時間對鮮切萵筍各項品質指標的影響如圖2所示。由圖2可知，不同超聲時間處理顯著影響鮮切萵筍的保鮮效果，超聲時間為10 min時失重率和a*值上升最為緩慢，第8 d時失重率相較于對照組降低了19.31%，而15 min和20 min的超聲時間可能因為超聲時間過長破壞了細胞膜的結構，導致其失水程度甚至高于對照組。萵筍經切割后感官評價呈現出整體下降的趨勢，超聲時間10 min作用下能更好地減少萵筍表面的腐敗菌但較少破壞萵筍的組織結構，故感官評價達(19.00±1.00)分，相較于其他條件得分更高，是對照組的0.508倍。新鮮萵筍中葉綠素的含量為4.900 mg/100 g，低溫貯藏8 d后超聲10 min處理條件下的鮮切萵筍葉綠素含量最高，相較于其他處理條件更好地維持了色澤品質。因此，根據單因素實驗結果結合實際生產的經濟性，選擇超聲時間為5、10、15 min進行響應面優化試驗為宜。

(3)超聲溫度對鮮切萵筍保鮮效果的影響。超聲溫度對鮮切萵筍各項品質指標的影響如圖3所示。由圖3可知，超聲處理溫度顯著影響鮮切萵筍的保鮮品質。65 ℃處理時，處理組和對照組的a*值上升極為顯著；25 ℃處理下較為顯著；35 ℃和45 ℃處理時，處理組區別并不顯著；但45 ℃處理下a*值上升最為緩慢，是對照組的2.136倍。鮮切萵筍在前6 d時，65 ℃處理時處理組較其他組感官評價下降最為迅速，在第8 d用45 ℃處理時，處理組感官評價為(19.333±2.517)分，是對照組的0.465倍。葉綠素含量在貯藏期間呈下降趨勢，低溫貯藏2 d后，45 ℃處理條件下葉綠素含量下降最慢，對照組下降最快。經過8 d低溫貯藏后45 ℃處理條件下的鮮切萵筍葉綠素含量最高，為(2.519±0.039) mg/100 g，相較于其他處理條件更好地維持了色澤品質，這與上面有關色差的研究結果基本一致。因此，根據單因素實驗結果結合實際生產的經濟性，選擇超聲溫度為35、45、55 ℃進行響應面優化試驗為宜。

圖1 超聲功率對鮮切萵筍品質指標的影響

圖2 超聲時間對鮮切萵筍品質指標的影響

(4)不同濃度ZnO NPs處理對鮮切萵筍保鮮效果的影響。ZnO NPs溶液濃度對鮮切萵筍各項品質指標的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著ZnO NPs溶液濃度的增加，其鮮切萵筍失重率和a*值呈先下降后上升的趨勢，且第8 d時ZnO NPs溶液濃度為0.07 g/L的失重率最低，為(2.553±0.037)%，比對照組降低0.366倍；a*值上升最為緩慢。感官評價和葉綠素含量均呈先上升后下降趨勢，在第0 d時各處理組間差異性不大，均呈現出良好的感官品質，然而自第2 d起，對照組開始較其他組感官評價下降迅速，0.07 g/L的ZnO NPs溶液濃度感官評價下降最慢；新鮮萵筍0.07 g/L濃度條件下葉綠素含量下降最慢，經過8 d低溫貯藏后葉綠素含量最高，為(3.718±0.096) mg/100 g,比對照組增加了49.25%，相較于其他處理條件更好地維持了色澤品質，這與上面有關色差的研究結果基本一致。因此，根據單因素實驗結果結合實際生產的經濟性，選擇ZnO NPs溶液濃度為0.05、0.07、0.09 g/L進行響應面優化試驗為宜。

圖3 超聲溫度對鮮切萵筍品質指標的影響

圖4 ZnO NPs溶液濃度對鮮切萵筍品質指標的影響

2.2 響應面試驗結果

(1)響應面試驗設計和結果。以超聲功率(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)、ZnO NPs溶液濃度(D)為自變量，以失重率(Y1)、a*值(Y2)和葉綠素含量(Y3)作為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗，響應面試驗設計及結果如表3、4所示，再對響應面結果進行多元回歸擬合分析，分析結果如表5所示。

表3 超聲協同ZnO NPs保鮮處理響應面實驗設計

采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗模型進行多元回歸擬合，其失重率(Y1)與超聲功率(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)和ZnO NPs濃度(D)的多元回歸方程為

Y1=0.36+0.11A+0.37B+0.67C+0.14D+0.23AB+0.065AC+0.013AD+0.49BC+

0.50BD-0.038CD+0.17A2+0.36B2+1.35C2+0.33D2。

由表5可見，鮮切萵筍失重率的回歸模型P值<0.01，說明該模型的回歸方程有統計學意義。失擬項P值為0.172 2>0.05，說明失擬項無統計學意義，無失擬因素存在；模型的復相關系數R2=0.981 7，校正相關系數Adj.R2=0.963 4，說明該模型與實際情況擬合很好，實驗誤差小，對鮮切萵筍失重率的預測準確性高。在回歸模型中，一次項B、C，交互項BC、BD和二次項B2、C2、D2有統計學意義(P<0.01)；一次項A、D，交互項AB和二次項A2有統計學意義(P<0.05)。由此表明各個試驗因子與響應值之間的關系不是簡單的線性關系。

表4 超聲協同ZnO NPs保鮮處理響應面實驗結果

采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗模型進行多元回歸擬合，其a*值(Y2)與超聲功率(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)和ZnO NPs濃度(D)的多元回歸方程為

Y2=-9.93-0.16A-1.75B-3.22C-0.093D-0.17AB+0.10AC+0.030AD-0.70BC+

0.070BD-0.50CD+1.88A2+2.63B2+3.09C2+1.87D2。

由表5可見，鮮切萵筍a*值的回歸模型P值<0.01，說明該模型的回歸方程有統計學意義。失擬項P值為0.077 8>0.05，說明失擬項無統計學意義，無失擬因素存在；模型的復相關系數R2=0.966 1，校正相關系數Adj.R2=0.932 2，說明模型的擬合程度較好，可用該回歸方程對試驗結果進行分析和預測。在回歸模型中，一次項B、C和二次項A2、B2、C2、D2有統計學意義(P<0.01)。

采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗模型進行多元回歸擬合，其葉綠素含量(Y3)與超聲功率(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)和ZnO NPs濃度(D)的多元回歸方程為

Y3=0.77-8.333E-004A+3.333-003B+0.058C+6.667-003D+5.000-003AB-2.500

-003AC+0.010AD+0.060BC-0.020BD+0.030CD-0.093A2-0.12B2-0.087C2-0.16D2。

由表5可見，鮮切萵筍葉綠素含量的回歸模型P值<0.01，說明該模型的回歸方程有統計學意義。失擬項P值為0.978 8>0.05，說明失擬項無統計學意義，無失擬因素存在；模型的復相關系數R2=0.954 4，校正相關系數Adj.R2=0.908 8，說明該模型與實際情況擬合很好，實驗誤差小，對鮮切萵筍葉綠素含量的預測準確性高。在回歸模型中，一次項C和二次項A2、B2、C2、D2有統計學意義(P<0.01)，交互項BC有統計學意義(P<0.05)。由此表明各試驗因子與響應值之間的關系不是簡單的線性關系。

表5 回歸模型的方差分析

(2)失重率的響應面曲線分析及優化。鮮切萵筍中的水分和營養物質因為呼吸作用和蒸騰作用很容易被消耗，造成萵筍重量上的損失，這是鮮切萵筍失重的主要原因，同時水分流失也是導致果蔬萎蔫、變質及腐爛的重要原因，故而失重率是評價鮮切萵筍失水程度的重要指標之一，具有重要的實踐意義。兩因素相互作用影響超聲協同ZnO NPs保鮮法失重率的響應曲面圖及等高線圖如圖5所示。由圖5可知，超聲功率(A)和超聲時間(B)的等高線偏圓形，響應面較為陡峭，說明AB間的交互作用對鮮切萵筍失重率的影響達到顯著水平；超聲時間(B)和超聲溫度(C)以及超聲時間(B)和ZnO NPs濃度(D)的等高線呈現橢圓形，響應面更陡峭，說明BC間和BD間的交互作用非常顯著，且BC和BD的交互效應對于鮮切萵筍失重率的影響程度較高。

圖5 兩因素相互作用影響超聲協同ZnO NPs保鮮法失重率的響應曲面圖及等高線圖

(3)a*值的響應面曲線分析及優化。鮮切萵筍在貯藏過程中的褐變主要是多酚物質的氧化所導致的，當萵筍呈新鮮狀態時，多酚與O2被區域化隔離，當對萵筍進行切割時，多酚與O2接觸，從而發生反應產生紅棕色醌，醌在植物體內可以發生自身聚合或與細胞內的氨基酸和蛋白質發生反應產生黑色或褐色的沉淀物。兩因素相互作用影響超聲協同ZnO NPs保鮮法a*值的響應曲面圖及等高線圖如圖6所示。由圖6可知，超聲溫度對鮮切萵筍a*值影響較大，可能與溫度升高易破壞多酚氧化酶(PPO)活性有關。而超聲溫度、超聲功率和ZnO NPs溶液濃度對鮮切萵筍a*值的影響不顯著，表現為其響應面較為平緩。

圖6 兩因素相互作用影響超聲協同ZnO NPs保鮮法a*值的響應曲面圖及等高線圖

(4)葉綠素含量的響應面曲線分析及優化。葉綠素含量是影響萵筍及其加工品色澤的重要因素，其在光照、高溫等條件下易分解導致葉綠素含量的降低。兩因素相互作用影響超聲協同ZnO NPs保鮮法葉綠素含量的響應曲面圖及等高線圖如圖7所示。由圖7可知，超聲時間(B)和超聲溫度(C)的等高線偏圓形，響應面較為陡峭，說明BC間的交互作用對鮮切萵筍葉綠素含量的影響達到顯著水平。超聲時間和超聲溫度對鮮切萵筍葉綠素含量影響較大，可能是由于溫度過高加速了葉綠素的分解。

圖7 兩因素相互作用影響超聲協同ZnO NPs保鮮法葉綠素含量的響應曲面圖及等高線圖

(5)各因素間的交互作用分析。響應面圖可以評價實驗因素對響應值的交互作用的大小，以確定最佳的水平范圍。響應曲面的坡度越陡峭，則表明響應值對條件的改變越敏感，相反，如果響應面的坡度相對平緩，則表明鮮切萵筍可以忍受處理條件的改變，而不影響到響應值的大小。根據Design Expert 8.0.6軟件對不同條件處理鮮切萵筍的最佳工藝參數回歸方程擬合優化后，得到超聲協同ZnO NPs處理鮮切萵筍保鮮的最佳工藝為超聲功率297.21 W、超聲時間10.50 min、超聲溫度46.47 ℃、ZnO NPs溶液濃度0.07 g/L。為方便實驗，將最佳工藝優化后取為超聲功率300 W、超聲時間10 min、超聲溫度46 ℃、ZnO NPs溶液濃度0.07 g/L。在此條件下保鮮貯藏8 d的鮮切萵筍失重率為(0.23±0.002)%，比對照組降低0.245倍；a*值和葉綠素含量分別為(-9.98±0.19) mg/100 g和(1.340±0.044) mg/100 g，比對照組增加66.89%和51.64%。

3 結論

本試驗研究不同超聲功率、超聲時間以及超聲溫度處理對鮮切萵筍保鮮效果的影響，并對最佳處理條件進行響應面優化，確定超聲協同ZnO NPs保鮮方法的最佳配比。實驗結果如下：①超聲協同ZnO NPs處理鮮切萵筍的最佳工藝條件為超聲功率300 W，超聲時間10 min，超聲溫度46 ℃，ZnO NPs溶液濃度0.07 g/L，在此條件下鮮切萵筍保鮮效果較好，a*值和葉綠素含量分別可達-9.98和1.340 mg/100 g，貯藏8 d后的鮮切萵筍失重率可降低至0.23%；②超聲協同ZnO NPs處理顯著抑制鮮切萵筍失重率的上升，抑制莖部切口褐變，延遲腐爛的速度，減緩葉綠素的降解，能夠較好地維持鮮切萵筍的感官品質。但超聲功率過高會增大鮮切萵筍的失水速度，適宜功率的超聲波處理隨著時間的延長也會增大鮮切萵筍的失水率，超聲溫度升高有助于減少鮮切萵筍表面微生物，但溫度升高到一定時，鮮切萵筍的失重率也會受到一定影響。溫度和功率均會影響鮮切果蔬保鮮過程中SOD、POD、PPO和CAT等相關酶的活性，從而影響鮮切果蔬的貯藏品質。