阿司匹林調控DDR1對大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡的影響

陳璐，吳靜霞，劉曉燕，蔣志濤

(張家港市中醫醫院藥學部，江蘇 張家港 215600)

目前腦卒中已成為全球致死和致殘的第二大原因[1-2]，其典型病理特征為突發性神經功能損傷。研究表明，缺血性腦卒中的發病率約為69.6%，居所有腦卒中的第一位[3]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischiemia-reperfusion injury，CIRI)導致的遲發性神經損傷極大地影響患者的預后以及神經功能的恢復。既往研究表明，CIRI是一種復雜的級聯反應性病理生理過程，其機制主要涉及氧化應激、炎癥、細胞自噬、細胞凋亡等[4-5]。但目前有關CIRI的具體分子作用機制以及藥物治療尚不完全明確。阿司匹林是臨床上常用的非甾體抗炎藥物，在抗血栓形成以及神經保護中發揮重要作用。基礎與臨床研究發現，阿司匹林能夠降低大鼠CIRI細胞凋亡，改善神經損傷[6-7]，但阿司匹林對大鼠CIRI神經細胞凋亡的作用機制尚不完全清楚。盤狀結構域受體1(discoid domain receptor 1，DDR1)是一種非整合素膠原受體，為酪氨酸激酶蛋白家族成員之一，廣泛參與細胞增殖、凋亡等[8-9]。DDR1在大鼠CIRI中發揮重要作用。大鼠CIRI模型中DDR1表達顯著升高，抑制DDR1可以降低基質金屬蛋白酶9的表達，從而降低血腦屏障的通透性[10]。本研究旨在探究阿司匹林通過調控DDR1表達對大鼠CIRI神經細胞凋亡的影響，以期為CIRI神經細胞凋亡的研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體級雄性6～8周齡SD大鼠30只，體重180～200 g，由安徽醫科大學實驗動物學部提供，生產許可證合格證號：SCXK(皖)2017-0001，本實驗經動物實驗醫學倫理委員會批準。

1.2藥品與試劑 阿司匹林腸溶片(徐州恩華藥業集團有限公司，批號：20171001)；蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(江蘇碧云天生物技術公司，批號：C0105S)；原位末端轉移酶標記技術(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司，批號：C1091)；DDR1一抗(美國Cell Signaling Technology，批號：5583)；胱天蛋白酶3(caspase-3)一抗(美國Cell Signaling Technology，批號：14220)；B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)一抗(美國Cell Signaling Technology，批號：15071)；Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗(江蘇碧云天生物技術公司，批號：89477)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(江蘇碧云天生物技術公司，批號：5174)；一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術公司，批號：P0023A)；小鼠二抗(江蘇碧云天生物技術公司，批號：A0286)；兔二抗(江蘇碧云天生物技術公司，批號：A0277)；極超敏ECL發光試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司，批號：P0018FS)。

1.3儀器 高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司生產，型號：G22-W)；多功能酶標儀[Thermo賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產，型號：SuPerMax 3000FA]；組織渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司生產，型號：M371450)；熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus有限公司生產，型號：TC-XDS-500C)；Western blotting檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司生產，型號：DYCZ-40D)；成像系統(美國Bio-Rad伯樂公司生產，型號：GoodLook-1000)。

1.4動物建模及分組 30只SD大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、腦缺血再灌注組和阿司匹林干預組，每組10只。其中腦缺血再灌注組采用0.2 mm的尼龍線制作栓子，按照參考文獻[11]進行相應操作，將大鼠取仰臥位固定，沿頸正中線切開，分離肌肉和筋膜、左側頸總動脈、頸外動脈以及頸內動脈，并在頸總動脈遠心端、近心端以及頸外動脈處用細線掛線備用，其中腦缺血再灌注組大鼠采用線栓結扎，假手術組大鼠只穿線不結扎。腔內線栓法制作大鼠腦中動脈栓塞模型，缺血2 h后，拔出栓子再灌注24 h。假手術組大鼠不插入栓子，余手術操作方法與腦缺血再灌注組一致。阿司匹林干預組大鼠在腦缺血再灌注模型基礎上給予阿司匹林藥物灌胃處理，在再灌注0 h和6 h時分別予阿司匹林60 mg/kg灌胃，其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃處理。

1.5HE染色 再灌注24 h，迅速采用端頭取腦，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%的多聚甲醛固定各組大鼠腦組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行腦組織染色。

1.6TUNEL染色測定細胞凋亡 實驗取材如HE染色，TUNEL法測定腦細胞凋亡，細胞核呈棕色的細胞為凋亡細胞。細胞凋亡率(%)=棕色細胞數目/總細胞數目。

1.7Western blot檢測腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1表達 取各組大鼠的腦組織放置于組織研磨管內，按照1∶4的比例加入組織裂解液并置于冰上裂解40 min，期間每間隔5分鐘進行腦組織渦旋振蕩，以保證裂解完全，將裂解后的離心管置于離心機內，在4 ℃條件下，以離心半徑18 cm、12 000 r/min離心10 min，取組織上清液。二辛喹酸法測定蛋白質濃度，按照35 μg/孔上樣，電泳，轉膜，孵育caspase-3一抗(1∶1 000)、Bcl-2一抗(1∶500)、Bax一抗(1∶1 000)以及DDR1一抗(1∶500)，4 ℃條件下孵育16 h，洗膜，孵育對應的二抗室溫孵育60 min，TBST緩沖液(吐溫20磷酸緩沖鹽溶液)洗膜5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照。圖片掃描后用Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶灰度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠腦神經元形態學變化 HE染色觀察各組大鼠腦神經元形態特征，結果顯示，假手術組腦神經完整，無典型的病理損傷；腦缺血再灌注組海馬CA1區域椎體細胞稀疏、有大量空泡，細胞間質增寬，細胞核固縮；阿司匹林干預組CA1區域椎體細胞增多、空泡減少，細胞間質變窄，腦神經結構出現好轉。見圖1。

2.2各組大鼠腦神經元細胞凋亡比較 TUNEL染色檢測各組大鼠腦神經元細胞凋亡，結果顯示，假手術組、腦缺血再灌注組、阿司匹林干預組細胞凋亡率分別為(8.98±2.50)%、(50.25±8.50)%、(30.25±9.44)%，三組比較差異有統計學意義(F=28.431，P<0.001)。與假手術組相比，腦缺血再灌注組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預組神經元細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注：HE為蘇木精-伊紅

注：TUNEL為原位末端轉移酶標記技術

2.3各組大鼠腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1蛋白表達比較 各組大鼠腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1蛋白表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，與假手術組相比，腦缺血再灌注組腦組織caspase-3、Bax和DDR1蛋白表達均顯著上調，而Bcl-2表達顯著下調(P<0.01)。與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預組腦組織caspase-3、Bax和DDR1蛋白表達顯著下調，而Bcl-2表達顯著上調(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1蛋白表達比較

3 討 論

阿司匹林是一種經典的解熱鎮痛和抗風濕藥，在腫瘤、神經系統疾病以及心腦血管疾病中發揮重要療效[12]。CIRI是臨床常見的一種心腦血管性疾病，指腦組織缺血后于一定時間恢復血液供應誘發腦功能障礙加重的現象。代謝障礙、氧自由基的合成增加、細胞鈣穩態失衡以及細胞凋亡等是CIRI的關鍵分子調節機制[13-14]。既往文獻發現，阿司匹林能夠改善CIRI神經損傷，其作用機制為通過抑制細胞凋亡降低炎癥、改變腦血管屏障等[15-16]。另外，阿司匹林能夠通過抑制核因子κB信號通路和降低炎癥細胞因子(如白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α)緩解CIRI大鼠神經損傷[16]。

細胞凋亡是維持自身穩態的重要調節機制，又稱程序性細胞死亡。caspase-3和Bcl-2表達失衡是造成細胞凋亡機制改變的重要因素[17]。本研究結果顯示，腦缺血再灌注組海馬CA1區域椎體細胞稀疏、有大量空泡，細胞間質增寬，細胞核固縮。阿司匹林灌胃CIRI大鼠海馬CA1區域椎體細胞增多、空泡減少，細胞間質變窄；進一步觀察阿司匹林對腦神經元細胞凋亡的影響，結果顯示，與假手術組相比，腦缺血再灌注組細胞凋亡率顯著升高；與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預組神經元細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

細胞凋亡是caspase-3介導的程序性死亡，Bcl-2/Bax表達比例失衡是造成細胞凋亡的關鍵因素[17]。本研究通過Western blot檢測凋亡相關蛋白表達水平，結果顯示，與假手術組相比，腦缺血再灌注組腦組織caspase-3、Bax表達均顯著上調(P<0.05)；與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預組腦組織caspase-3、Bax表達顯著降低(P<0.05)，表明阿司匹林能夠通過抑制細胞凋亡改善CIRI神經損傷。

DDR1是一種酪氨酸蛋白受體激酶，主要分為細胞膜外結構域、跨膜結構域以及細胞內激酶結構域，在多種組織和器官中廣泛性表達。研究表明，當細胞接受外界膠原蛋白的刺激后可與DDR1細胞膜外結構域結合，并最終引起DDR1細胞內結構域活化介導細胞增殖、遷移以及凋亡等一系列病理生理過程[9]。DDR1在腦缺血再灌注中發揮重要作用。大鼠局灶性腦缺血損傷模型的DDR1表達顯著升高，抑制DDR1能夠降低基質金屬蛋白酶9的表達，減輕血腦屏障和腦缺血損傷[18]。另外，在腫瘤和糖尿病血管內皮損傷中，DDR1表達顯著升高，抑制DDR1能夠減少腫瘤細胞增殖和高糖誘導的血管內皮細胞凋亡[8,19]。故推測，DDR1可能參與阿司匹林抑制CIRI神經細胞凋亡過程。本研究結果顯示，與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預組腦組織DDR1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。DDR1能夠通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路調控細胞增殖和凋亡[19]。另外，DDR1也能夠通過調控Noth1和核因子κB信號調節腫瘤細胞分化與細胞凋亡相關基因表達，如Bcl-2、細胞周期蛋白D[20-21]。由此可見，阿司匹林可通過下調DDR1表達抑制神經元細胞凋亡，進而發揮CIRI神經保護作用。但阿司匹林通過下調DDR1抑制CIRI神經元細胞凋亡的分子機制尚未闡明。

綜上所述，阿司匹林可改善腦缺血再灌注大鼠神經損傷，其機制可能與阿司匹林抑制DDR1蛋白表達、減少細胞凋亡相關。