FSHR基因多態性與卵巢反應性及臨床結局的相關研究

馬卓群，楊怡卓，張蔓麗，穆莎，彭紅梅*

(1.解放軍醫學院，北京 100853；2.中國人民解放軍總醫院第一醫學中心婦產科，北京 100853；3.中國人民解放軍總醫院轉化實驗室，北京 100853)

在輔助生殖技術(ART)應用中，控制性促排卵(COH)是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)這一復雜程序的關鍵步驟，也是獲得一定數目且高質量卵母細胞和理想臨床妊娠率的重要前提和保障。但因個體差異難以在COH前準確預測卵巢對外源性卵泡刺激素(FSH)刺激的反應。有些患者對外源性FSH敏感性較低，導致獲卵過少，出現無可移植胚胎的情況，卵巢低反應患者在行助孕治療總人群中大約占9%～24%[1]。而有些患者敏感性較高，易導致卵巢過度刺激綜合征(OHSS)，只能取消新鮮周期移植，甚至出現腹水、胸水等癥狀[2]。因此如何在COH過程中提前預測患者的卵巢反應性，對制定個性化的治療方案十分重要。FSH由腦垂體前葉合成和分泌，主要通過與顆粒細胞膜表面的特異性FSH受體(FSHR)結合，發揮其調節蛋白表達和細胞發育的作用，以維持生殖系統的動態平衡。有研究表明，FSHR多態性可能影響基礎FSH(bFSH)和E2水平，FSHR基因和其他基因變異可能在調節受體敏感性和其他促性腺激素(Gn)方面發揮作用[3]。近年來，有研究報道，FSHR單核苷酸多態性(SNP)可能與卵巢反應性具有一定關聯[4]。因此，本研究通過前瞻性研究，對接受IVF-ET助孕治療的不孕癥女性FSHR基因rs6165(Thr307Ala)、rs6166(Asn680Ser)位點多態性進行檢測，分析其與卵巢反應性及OHSS發生的相關性。

資料與方法

一、研究對象

招募2020年10月至2021年12月在中國人民解放軍總醫院第一醫學中心生殖醫學中心進行IVF-ET助孕治療的女性患者為研究對象。納入標準：(1)年齡≤38歲；(2)本取卵周期為首次取卵周期。排除標準：(1)輸卵管、卵巢手術史或結核史；(2)化療史、盆腹腔放療史；(3)既往或現患有影響Gn或生殖激素分泌及代謝的疾病；(4)受試前3個月內使用藥物或口服避孕藥。

共納入551例不孕癥患者。本研究設計經中國人民解放軍總醫院倫理委員會批準通過(倫理審查號：S2020-374-01)，所有研究對象均同意加入本研究并充分知情同意后簽署知情同意書。

二、研究方法

1.COH：通過陰道B超監測卵巢卵泡發育情況并結合患者bFSH、抗苗勒管激素(AMH)水平和體質量指數(BMI)等各項指標制定合適的促排卵方案，如拮抗劑方案、長方案、短方案、微刺激方案等。當優勢卵泡>18 mm、至少有3個卵泡≥16 mm時，肌肉注射HCG(珠麗海珠制藥)10 000 U。HCG注射后36 h在超聲引導下取卵。

2.IVF-ET或凍融胚胎移植(FET)：對患者病史及取卵結果進行評估后選擇IVF或ICSI人工授精，受精后16～18 h觀察受精狀態，見到雙原核(2PN)者為正常受精，則繼續體外培養。根據《人類體外受精-胚胎移植實驗室操作專家共識》[5]和Gardner標準[6]分別對卵裂期胚胎及囊胚進行評級。根據患者病史、獲卵數及取卵后有無OHSS發生風險等綜合判斷是否進行新鮮胚胎移植，或將可利用胚胎玻璃化冷凍后擇期行FET。所有患者均移植1～2枚卵裂期胚胎或囊胚(優先選擇優質胚胎)，新鮮移植或FET后均行常規黃體支持。

3.SNP檢測：取卵當日，抽取患者外周靜脈血5 ml保存于EDTA抗凝管中；按照DNA提取試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit 51106(250)(QIAGEN，德國)說明書操作，提取血液樣本的DNA，并經分光光度計測定其濃度及純度。使用Primer Premier 5.0軟件進行FSHR基因SNP位點rs6165(Thr307Ala)、rs6166(Asn680Ser)的引物設計，具體引物序列見表1。本實驗所需引物均由上海生工生物工程股份有限公司(北京)合成。對目的DNA片段進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，使用KOD FX Neo Polymerase試劑盒(KFX-201，TOYOBO，日本)進行實驗。經預實驗，兩個反應可共用1個反應條件。PCR體系為50 μl，反應體系由25 μl的2×PCR buffer、10 μl dNTPs(2 mmol/L)、上/下游引物(10 μmol/ml)各1.5 μl、1 μl的DNA樣品、10 μl滅菌蒸餾水和1 μl KOD FX(1.0 U/μl)組成。擴增條件：94℃×2 min；98℃×10 s，55℃×30 s，68℃×30 s，35個循環；68℃×5 min。PCR反應完成后，使用1%的瓊脂糖膠電泳分析PCR產物，觀察顯影結果，拍照保存并導出圖像。目標DNA片段切膠回收，將回收純化的PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司(北京)進行一代測序。測序結果返回后，通過Chromas軟件查看測序質量和結果，并利用Mutation Surveyor 4.0.5軟件將測序結果與原序列進行比對分析，確定是否存在特異的SNP位點，并統計基因型。

表1 FSHR基因SNP引物

4.研究分組：根據多態性位點基因型檢測結果，將rs6165(Thr307Ala)分為A/A組(273例)、A/G組(224例)和G/G組(54例)，rs6166(Asn680Ser)亦分為A/A組(272例)、A/G組(231例)和G/G組(48例)。

5.觀察指標及判斷標準：記錄患者的一般資料[年齡、BMI、基礎竇卵泡數(AFC)、AMH、bFSH、bLH水平]、促排卵及胚胎發育情況(促排天數、外源性FSH劑量、總卵泡數、獲卵數、MⅡ卵母細胞數，正常受精數、正常卵裂數、優質胚胎數、囊胚形成率)、臨床妊娠率，以及各組中卵巢反應情況和OHSS發生率。

胚胎移植后14 d行血HCG檢測，陽性者于移植后28 d行陰道超聲檢查，見宮腔內孕囊及胎心搏動者確定為臨床妊娠。卵巢低反應指獲卵數≤4枚者，正常反應指5枚≤獲卵數≤15枚，高反應指獲卵數>15枚。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況

本研究共納入551例患者，FSHR基因SNP位點rs6165、rs6166各等位基因與基因型的分布情況見表2。

表2 FSHR基因SNP位點rs6165、rs6166等位基因與基因型分布情況

二、rs6165(Thr307Ala)不同基因型組間比較

rs6165(Thr307Ala)3種基因型分組的患者年齡、BMI、AMH等一般資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)；3組患者的促排卵天數、外源性FSH劑量、總卵泡數、獲卵數亦無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的MⅡ卵母細胞數顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表4)；3組患者的正常卵裂數、優質胚胎數、囊胚形成率、臨床妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的正常受精數顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表5)。

表3 rs6165不同基因型組別的一般資料比較(-±s)

表4 rs6165不同基因型組別促排卵情況比較(-±s)

表5 rs6165不同基因型組別的受精及胚胎發育情況比較((-±s)，%)

三、rs6166(Asn680Ser)不同基因型組間比較

rs6166(Asn680Ser)3種基因型分組的患者年齡、BMI、AMH等一般資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6)；3組患者的促排天數、外源性FSH劑量、總卵泡數、獲卵數亦無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的MⅡ卵母細胞數顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表7)；3組患者的優質胚胎數、囊胚形成率、臨床妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的正常受精數、正常卵裂數顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表8)。

表6 rs6166不同基因型組別的一般資料比較(-±s)

表7 rs6166不同基因型組別的促排卵情況比較(-±s)

表8 rs6166不同基因型組別的受精及胚胎發育情況比較[(-±s)，%]

四、FSHR基因多態性與卵巢反應性及OHSS發生的相關分析

rs6165(Thr307Ala)A/A基因型組卵巢低反應發生率顯著低于A/G基因型和G/G基因型(P<0.05)；其余基因型中不同卵巢反應性情況無顯著性差異(P>0.05)(表9)。rs6166(Asn680Ser)A/A基因型組卵巢低反應發生率亦顯著低于A/G基因型和G/G基因型(P<0.05)(表10)。在551例納入患者中，有53名患者發生OHSS，rs6165和rs6166不同基因型組別中OHSS發生率無顯著性差異(P>0.05)(表9、10)。

表9 rs6165不同基因型組別中卵巢低、中、高反應發生情況[n(%)]

表10 rs6166不同基因型組別中卵巢低、中、高反應發生情況[n(%)]

討 論

目前，通過FSH、E2、AMH等激素水平檢測及AFC等來預測卵巢反應性及獲卵數已經成為ART過程中常規檢測的一部分[7]。近年來FSHR基因多態性與卵巢反應性的關聯逐漸被關注[8]。FSHR基因多態性評估尚不可以取代傳統的卵巢儲備檢測，但是與傳統檢測方法相比，評估個體的FSHR基因多態性可以了解甚至更好地預測某些特定或難以治療患者的卵巢反應性[9]，對制定誘導排卵的個體化方案存在潛在價值。

本研究納入的551例助孕女性中，SNP位點FSHRrs6165(Thr307Ala)A/A基因型和rs6166(Asn680Ser)A/A基因型是最常見的基因型，頻率分別為49.54%和49.36%。之前國外學者的相關研究提出，rs6165(Thr307Ala)A/G基因型和rs6166(Asn680Ser)A/G基因型是高加索人種中最常見的基因型[10-12]。提示FSHR多態性的分布差異可能與種族、地域有關。

有研究通過監測排卵周期中垂體和卵巢激素的分泌模式，發現rs6165(Thr307Ala)參與人類月經周期時長和周期的改變[13]。有文獻報道，在COH過程中，rs6165(Thr307Ala)G/G基因型的印度婦女可能更適合低劑量的FSH進行卵巢刺激，且該基因型發生OHSS的風險增加[14]。2021年一項研究提出，rs6165(Thr307Ala)A/A基因型的女性比其他基因型女性促排天數更短、所需外源性FSH劑量更少[15]，但本研究中這種差異并不明顯。在巴西開展的一項研究指出，基因多態性并不決定bFSH和E2水平以及ART治療中的卵巢反應，但rs6165(Thr307Ala)G/G基因型女性的MⅡ期卵母細胞數和胚胎數量明顯高于A/G基因型和/A/A基因型[16]。而本研究結果顯示，rs6165(Thr307Ala)A/A基因型患者MⅡ期卵母細胞數與正常受精數均顯著高于基因型A/G的患者，這可能是由于地域和人種因素導致的差別。

都在外顯子10上的兩個SNP即rs6165(Thr307Ala)與rs6166(Asn680Ser)之間有很強的連鎖性，迄今為止大多數研究都集中在rs6166(Asn680Ser)。有研究表明，rs6166(Asn680Ser)A/A基因型女性月經周期較G/G基因型女性長2.3 d左右[17]。一項共納入4 020例婦女的薈萃分析也證明，與其他基因型相比，rs6166(Asn680Ser)A/A純合子基因型女性bFSH水平較高，并且需要更多的外源性FSH來誘導卵泡發育以達到相同的卵泡刺激效果，高基礎水平通常預示著卵巢對FSH反應的閾值更高[18]。關于不同基因型患者的臨床妊娠結局，有個別文獻提出rs6166(Asn680Ser)基因型與臨床妊娠結局有關，G/G純合子基因型患者的臨床妊娠率顯著高于其他基因型患者[19]。同時也有一些研究指出，rs6166(Asn680Ser)基因型與卵巢反應性[20]和累積活產率[21]無關。我們的研究結果顯示，各組臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05)；結合之前的文獻分析，認為FSHR基因多態性與臨床妊娠結局之間的關系尚存在爭議，可能是由于樣本數量較少或人種、地域差異所致。且因為本研究設計時將臨床妊娠率作為重點觀察指標，故未對納入患者的胚胎移植情況及種植率、生化妊娠率等進行分析，研究數據覆蓋不夠全面，研究結論存在一定的局限性，后續還需完善研究設計、延長隨訪時間進一步加以探討。

綜上所述，FSHR常見SNP位點rs6165(Thr307Ala)和rs6166(Asn680Ser)的不同基因型與卵巢反應性有一定關聯，可以為臨床制定個體化的COH方案提供參考；但其對妊娠結局及OHSS發生的影響并不明顯。由于樣本數量、標志物數據標準、統計描述方式、人口分層、遺傳變異(遺傳異質性，人口歷史)、環境因素等的干擾，研究結論目前尚存在爭議，將來還應考慮FSH-FSHR系統的遺傳復雜性，從藥物遺傳學、生理學信號轉導等角度進一步深入研究；且由于基因檢測的成本較高，該檢測方法的普及使用尚有待研究。