羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗

張莉敏，常攀峰，黨 巖，張述斌，馬志宏

（甘肅省畜牧獸醫研究所，甘肅 平涼 744000）

羊接觸傳染性膿皰性皮炎俗稱羊口瘡（ORF），又稱羊傳染性膿皰（contagious ecthyma,CE）或羊傳染性膿皰性皮炎（contagious pustular dermatitis,CPD），是一種由羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒引起的急性接觸性傳染病，患羊在口腔黏膜、唇側唇部、面部、腿部和乳房部的皮膚形成丘疹、膿皰、潰瘍及結痂，影響采食、哺乳及運動，導致患羊身體衰弱，繼發感染其他疾病而死亡[1]。我國養羊的地區均有該病流行。甘肅省畜牧獸醫研究所從20世紀80年代開始經多年研究，從多株羊傳染性膿皰病毒中選育出毒力強、免疫原性好的HCE毒株，在犢牛睪丸細胞上連續繼代致弱，培育出免疫原性較好的弱毒株，在此基礎上研究出的細胞弱毒凍干疫苗免疫保護率達75%以上，免疫期3個月[2]。交互免疫試驗證明對甘肅、青海、新疆、內蒙古、湖北、廣州、云南等10多個地區綿山羊傳染性膿皰病毒的攻擊均有良好的保護作用。該疫苗于1989年通過專家驗收鑒定，獲甘肅省科學技術進步獎三等獎，原農業部生物制品規程委員會審議通過了《羊傳染性膿皰皮炎活疫苗的制造及檢驗規程》，原農業部頒發了《新獸藥證書》，產品在原蘭州生物藥品廠進行中試生產，推廣應用于甘肅、陜西、湖北、內蒙古等地。該疫苗采用口唇劃痕法接種，方法簡單、易掌握，對發病羊群免疫可控制該病流行，對潛伏期羊只免疫可使發病癥狀減輕，特別對1月齡左右的羔羊和育成羊具有良好的保護作用。

該病免疫學的特殊性及日益廣泛的世界貿易活動，導致我國原在西北地區已經控制的ORF，近年來在全國普遍流行，特別是山東、天津、北京和江蘇等地流行嚴重，給我國養羊業造成了巨大的經濟損失[3]。在這樣的情況下，甘肅省畜牧獸醫研究所與山東華宏生物工程有限公司合作，進行羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗研制，以求盡快將羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗應用于生產中。本文就羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒苗的免疫攻毒試驗報告如下。

1 試驗材料

1.1 種毒

試驗用的ORF種毒來源于甘肅省畜牧獸醫研究所動物醫學研究室種毒試驗室。

1.2 動物與疫苗

試驗羊為甘肅省平涼市崆峒區某羊場的健康羔羊。羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗由山東華宏生物工程有限公司和甘肅省畜牧獸醫研究所協作生產。

1.3 場所與儀器設備

試驗場所設在甘肅省畜牧獸醫研究所動物房。儀器設備由甘肅省畜牧獸醫研究所提供。

1.4 藥品與試劑

NaCl、CaCl2、KCl、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、葡萄糖、酚紅、NaHCO3等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。Hanks原液及應用液、1%酚紅、7.5% NaHCO3等按常規配制。

2 試驗方法

2.1 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒預試驗

選擇6月齡左右的健康綿羊25只，隨機分為5組，每組5只。每組羔羊分別用10 mg/ml、10 mg/ml×3.2-1、10 mg/ml×3.2-2、10 mg/ml×3.2-3、10 mg/ml×3.2-4的HCE強毒進行口腔下唇黏膜劃痕攻毒0.2 ml，觀察8 d并記錄試驗結果。

2.2 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗

選擇6月齡左右的健康綿羊16只，隨機分成3個試驗組和1個對照組共4組，每組4只。3個試驗組分別以正常劑量疫苗組、5倍稀釋疫苗組和25倍稀釋疫苗組進行口腔黏膜劃痕接種0.2 ml，觀察21 d[4]。試驗組羊免疫試驗21 d后，對試驗組和對照組羊只用100 ID80HCE強毒口腔黏膜劃痕攻擊，觀察10 d并記錄試驗結果[5]。

3 結果與討論

3.1 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒預試驗結果

由表1可知，ID100為第四組，ID60為第五組。根據《獸藥質量標準》（2017年版）和免疫學原理，選擇100 ID60/0.2 ml為攻毒劑量[6]。

表1 免疫攻毒預試驗效果

3.2 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗結果

由表2可知，相對于對照組而言，3個試驗組均對羊體有不同程度的保護作用，正常劑量疫苗組對羊體的保護作用達到100%，故這批ORF弱毒疫苗達到了《獸藥質量標準》中的規定。

表2 疫苗的免疫攻毒試驗測定結果

3.3 討論

羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗是ORF疫苗生產過程中疫苗成品效價測定的重要組成部分，也是控制疫苗生產質量的重要手段之一[7]。羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗成品的免疫攻毒試驗的準確性是決定疫苗質量的重要因素。由于羊接觸傳染性膿皰性皮炎的局部細胞免疫學的特點（大部分動物疾病以體液免疫為主，但有的疾病以細胞免疫為主，即以體內產生的細胞介質抗病，ORF是以細胞免疫為主的疾病，且僅感染動物皮膚黏膜，故具局部細胞免疫學的特點），羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗免疫過程中，免疫羊的血清抗體不易檢測，所以免疫攻毒試驗是檢驗疫苗免疫原理的可靠手段[8]。本試驗選擇100 ID60/0.2 ml為攻毒劑量，使免疫攻毒試驗的結果更加可靠。考慮到動物免疫攻毒試驗的個體差異對試驗結果的影響比較大，故在本試驗中增加了2個試驗組，提高了免疫攻毒試驗結果的可靠性。