機油降解真菌的篩選及降解效果的研究

吳燕紅，李 聰，石 冀，高煥方

(1.重慶理工大學 化學化工學院， 重慶 400054; 2.重慶匯亞環保工程有限公司， 重慶 400041)

0 引言

機油作為從石油中提煉出來的一種產品，在工業及日常生活中被廣泛使用，在生產、運輸、使用過程中的跑冒滴漏及突發性泄漏事故，含油污水的隨意排放等都對水資源造成了極大的污染[1-2]。機油主要是以多種復雜的碳氫化合物為主要成分的混合物，其中芳香烴對人的危害及毒性尤為突出[3]，會產生致癌、致畸和致突變作用[4]。現有的石油烴污染修復技術主要有化學修復法、物理修復法和生物修復法[5]，其中生物法利用降解菌轉化機油中石油烴類化合物，以此達到修復機油污染場地的目的，此方法成本低、效果好且無二次污染[6-7]。

微生物降解石油烴過程復雜，有多種酶參與。石油中不同烴類化合物的代謝途徑和機理是不同的[8]。已有許多研究證實真菌可作為石油烴降解菌[9]，其對石油烴的降解能力受石油組分、微生物種類、環境參數等的影響[10-12]。鄭金秀等[13]從污染土壤中分離到一株產生生物表面活性劑的菌株，與其他2株不產表面活性劑的菌株對比，能有效提高菌株對石油的降解效率，降解率最多可提高18.3%。目前，關于機油污染水體短時有效的修復技術，尤其對于加入表面活性劑作用的生物強化研究較少。

在篩選石油降解菌的基礎上，探討單一環境因素改變時，篩選出的真菌aspergillusversicolor降解機油的效果，并在此基礎上進行生物強化，探索投加表面活性劑進行生物強化降解污染廢水中機油的可行性。

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，去離子水定容至1 L，pH=7.0。

牛肉膏蛋白胨平板：牛肉膏蛋白胨培養基中加入1.5%～2.0%的瓊脂。

無機鹽基礎培養基(MSM)：磷酸二氫鈉8.5 g，磷酸二氫鉀3.0 g，氯化鈉4.0 g，氯化銨1.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，二水氯化鈣0.02 g，三氯化鐵0.02 g，一水硫酸錳0.004 g，七水硫酸鋅0.004 g，硫酸銅0.000 4 g，去離子水定容至1 L。

降解機油液體培養基：無機鹽基礎培養基加入濃度為2 500 mg/L機油。

試劑：磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、三氯化鐵、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、硫酸銅、無水硫酸鈉、石油醚(60～90)、無水乙醇等均購自成都市科隆化學品有限公司；牛肉膏、蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司、瓊脂購自上海麥克林生化科技有限公司，以上試劑均為分析純，40#機油(昆侖5w- 40)購自中國石油控股集團昆侖潤滑油有限公司，SN級。

儀器：ABI3730XL基因測序儀(上海艾研生物科技有限公司)、高壓蒸汽滅菌器-BIOBASE(山東博科生物產業有限公司)、Boxun博迅vs-840-2單人雙面垂直凈化工作臺(蘇州賽恩斯儀器有限公司)、SHP-100生化培養箱(上海精其儀器有限公司)、SHZ-82氣浴搖床(江蘇中和實驗儀器制造有限公司)、UV756CRT紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1菌種的篩選及鑒定

篩選：菌株篩選于重慶某場地石油烴污染土壤，取污染土壤10 g于含油無機鹽培養基中富集，后取其上清液在含無菌水試管中10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋，各取1 μL稀釋液在牛肉膏蛋白胨平板上進行涂布平板，后平板劃線純化出幾株對機油具有降解效果的單菌株，比較其降解效果，篩選出的菌株為真菌aspergillusversicolor。

ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’引物對樣品DNA進行擴增，采用Sanger法對PCR產物測序，PCR產物條帶大小約為500～750 bp，采用雙向引物測序，結果采用DNAMAN軟件6.0進行拼接處理，在NCBI數據中的BlastBI進行序列比對。

1.2.2機油降解率的測定方法

水中機油的提取：把樣品移入分液漏斗，量取10 mL的石油醚潤洗錐形瓶，后倒入分液漏斗中，充分震蕩3 min，期間需經常開啟旋塞排氣，靜置至液液分層，將下層液體轉移至燒杯中，重復上述步驟萃取3次，將萃取液體轉移至同一個燒杯[14]。在燒杯中加入450 ℃、4 h烘干后的無水硫酸鈉，補加至其呈流沙狀，后過濾至25 mL容量瓶，經稀釋后使用紫外可見分光光度計測定其吸光度。

紫外可見分光光度計標準曲線繪制：精確稱取0.1 g的機油，配置成100 mg/L的標準溶液，稀釋為濃度是5、10、20、30、40、50 mg/L的溶液，待測其吸光度，調節不同波長測同一標準液，以確定機油最佳吸收波長，波長為230 nm最佳，后以此波長測量不同濃度溶液吸光度，繪制標準曲線，結果如圖1。

圖1 不同濃度溶液吸光度曲線

式中：x1為空白樣的濃度，x2為降解后的濃度。

1.2.3實驗條件

實驗樣品為100 mL無機鹽培養液中加入0.25 g機油，配置成濃度為2 500 mg/L的機油降解培養基，121 ℃、30 min滅菌處理進行后續實驗，每個實驗樣品均做3次平行實驗，取其平均值。所有數據繪圖利用軟件Origin 2018進行繪制。

1) pH對降解效果的影響：用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH分別將機油降解培養基調節pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，鹽度4 g/L，加菌5%，以30 ℃、160 r/min在氣浴搖床中保持3 d，后測定其機油降解率。

2) 加菌量對降解效果的影響：將溶液調至pH=6.0，鹽度4 g/L，分別加菌1%、3%、5%、7%、9%，以30 ℃、160 r/min在氣浴搖床中保持3 d，后測定其機油降解率。

3) 鹽度對降解效果的影響：溶液pH=6.0，在每個樣品中分別加入NaCl為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g，加菌5%，以30 ℃、160 r/min在氣浴搖床中保持3 d，后測定其機油降解率。

4) 降解天數對降解效果的影響：溶液pH=6.0，加菌5%，鹽度3 g/L，以30 ℃、160 r/min，分別在氣浴搖床中保持24、48、72、96、120、144 h時，取出一組樣品測定其機油降解率。

5) 生物強化對降解效果的影響：選取生物表面活性劑槐糖脂、茶皂素，使用去離子水將其配置成100 g/L的溶液，分別在溶液pH=7.0，鹽度3 g/L，機油降解培養基中加入0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4 mL的槐糖脂溶液，加菌5%，以30 ℃、160 r/min在氣浴搖床中保持3 d，后測定其機油降解率。

2 結果與討論

2.1 篩選出的機油降解菌ITS基因鑒定

實驗篩選出的機油降解菌最初未經鑒定，將其暫時命名為WHY菌株，之后對其進行ITS基因測序，根據數據庫比對，篩選出的WHY菌株與aspergillusversicolorisolateZF210相似度最高，去除首尾多余序列后同源性為99.12%。據ITS序列結果顯示，WHY菌株為真菌aspergillusversicolor。機油降解菌WHY與親緣相近菌株ITS序列系統發育樹，如圖2。

圖2 機油降解菌與親緣相近菌株ITS序列的系統發育樹

2.2 環境因素對機油降解效果的影響

2.2.1pH的影響

圖3為菌株在不同pH條件下對水中機油的降解效果。由圖3可得，隨著含油無機鹽溶液中pH升高，菌株對機油的降解率呈上升趨勢，在pH=6.0時達最高降解率35.9%，至pH增加為6.0后，降解率迅速下降，由此表明菌株在中性偏堿性的環境中降解效果較差，因此菌株適宜生長于中性偏酸性環境中生長，實驗條件pH為6.0左右最佳。不同pH對機油降解效果的差異性是源于pH對菌株的生長及代謝有著重要的作用，影響菌株酶活性，細胞質的透性以及穩定性[15]。

圖3 菌株在不同pH條件下對水中機油的降解效果

2.2.2加菌量的影響

測定不同加菌量對水中機油的降解效果，結果見圖4。由圖4可觀察到，隨菌液量增加，整體降解效果呈增長趨勢，在7%時的降解率最高，可達36.7%，加菌量為9%時，降解率出現明顯下降，在5%～7%的加菌量范圍為最佳加菌量。由此可得，菌株加菌量的多少，與之能達到的降解率無正相關關系，這可能是在一定量的無機鹽培養基中，過多的菌株會造成過度繁殖，形成一種競爭，導致營養物質短缺，從而減緩菌株的生長，甚至由于惡劣的生存環境，可能會使其產生一些抑制生長甚至死亡的產物，菌株存活率隨之降低、死亡率增高。加菌量的多少會直接影響菌株的新陳代謝、生長速率、胞內酶活性、是否達到最佳生長狀態，從而影響機油的降解率。

圖4 不同加菌量對水中機油的降解效果

2.2.3鹽度的影響

無機鹽是菌株生長的重要營養物質，不同鹽濃度對菌株降解機油的效果如圖5所示。從圖中可以看到，真菌aspergillusversicolor對鈉鹽的耐受能力比較強且對其降解效果影響較大，在鹽濃度為3 g/L時，達到最好的降解效果，此時機油的降解率最高，為37.7%，當超過3 g/L時，降解率會隨著鹽濃度的升高而降低，這可能是當其超過鹽度適應極限[16-17]，過高的鹽濃度會影響菌株的代謝活性，使之對機油的降解能力減弱。

2.2.4降解天數的影響

隨著菌株在含油無機鹽培養基中降解時間的增加，它對水中機油的降解效果如圖6所示。從圖6中可以明顯看出，菌株對水中機油的降解速率隨著降解時間延長迅速上升，到了144 h后，降解速率變緩，幾乎與96 h的降解速率相近，此時能達到的最高降解速率在42.6%。這可能是由于菌株最初是以機油中的烷烴及小分子芳烴作為碳源，較易降解，隨著時間增加，小分子組分被分解，菌株才開始降解多環芳烴、膠質、瀝青質等較難降解的大分子組分，也可能是由于菌株對水中機油的分解，積累的有毒有害物質增多，造成了菌株的死亡，同時營養物質的缺失，也是造成其后期降解速率減緩的一個因素。探究降解時間對水中機油降解率的影響，有較大的經濟價值，避免增加時間成本、資源成本增加微弱的降解作用。

圖6 不同時間對水中機油的降解效果

2.3 生物強化對機油降解效果的影響

選用槐糖脂、茶皂素2種生物表面活性劑作為生物強化助劑，助劑的加入會顯著提高菌株對機油的降解效果[18-19]，強化后的降解率、機油剩余濃度見圖7。在加入1.4 mL的茶皂素溶液時，此時菌株對機油降解率最高可達71.2%，這是因為添加表面活性劑，可以增強非極性底物的乳化和溶解作用，以幫助底物和養分向菌株細胞輸送，促進其生長，同時促使機油形成微小顆粒，更容易在水溶液中分解[20]，同時增加O2和微生物的接觸，但是隨著表面活性劑濃度的增高，它的降解率并沒有隨之增加，反而呈現了下降的趨勢，這很有可能是由于表面活性劑的濃度超過臨界膠束濃度(CMC)時，會對菌株表現出一種毒害作用，因此，在表面活性劑的使用中，找到CMC對研究尤為重要。

圖7 槐糖脂、茶皂素濃度對機油降解效果的影響曲線

2.4 真菌好氧降解機油途徑

圖8反映了真菌好氧代謝降解石油烴中鏈烷烴、環烷烴、芳香烴的過程。真菌主要產生單加氧酶和細胞色素酶，以胞內酶參與反應[21]。在已有文獻中，多采用GC-MS測定石油烴產物[22]，在鏈烷烴時，通過直接脫氫(過程1)或加氧酶氧化(過程2)，將其轉化為脂肪酸，后經?氧化(過程3)降解為乙酰輔酶A，由三羧酸循環(過程4)分解為CO2、H2O和能量；在環烷烴中，經混合功能氧化酶氧化(過程6)為環烷醇，再經過程1和過程2轉化為內酯，或通過直接開環(過程5)，與鏈烷烴轉變為脂肪酸后途徑相似；到芳香烴，單加氧酶/細胞色素酶(反應7)將芳烴中苯環烴基化，其后一個氧原子加到苯環上(過程8)形成環氧化合物，經水解(過程9)和苯環斷裂(過程10)后形成各式酸類產物，最后分解為CO2和H2O等產物[23-24]。

圖8 真菌好氧代謝降解石油烴途徑示意圖

3 結論

1) 從石油烴污染場地土壤中篩選出的菌株，同樣適用于降解其他石油烴污染物，相較于大多數文獻中利用細菌降解，真菌對水體中的機油同樣具有較好的降解效果。

2) 多種環境因素都會對機油的降解效果產生較大影響，在接菌量5%、pH=6.0、鹽度3 g/L時，4 d是最節省時間和成本的最優條件。

3) 使用生物表面活性劑對菌株進行生物強化，對降解效果有極大的影響，對于探究和開發其他的生物表面活性劑協助菌株降解石油烴類物質有重要意義。