WT-1 mRNA表達動態分析對成人急性髓系白血病患者早期復發風險的預測價值

阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼，徐麗，艾克拜爾·阿布都熱衣木，努爾阿米娜·伊明尼亞孜

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是目前臨床較為常見的惡性骨髓克隆性疾病，根據FAB標準將AML分為M0～M7共計8種類型。目前研究顯示，早期發現并通過誘導治療可獲得較好的預后，但是有部分患者在緩解一段時間后出現病情反復的情況，需要盡早開展針對性治療延長生存周期[1-2]。WT-1是一組抑癌基因，其表達在AML患者中存在明顯的差異，有研究認為WT-1 與AML患者預后存在明顯相關性，但是將其運用于AML患者早期復發的研究則相對較少[3-4]。現將WT-1 運用于AML患者早期復發的預測，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年7月—2019年6月喀什地區第一人民醫院血液內科確診AML并經誘導治療獲得緩解的維吾爾族患者80例作為研究對象。以隨訪至2021年7月31日是否復發分為復發組22例和未復發58例(對照組)。復發組進行異基因干細胞移植(Allo-HSCT)治療占比低于對照組，危險度分級高危占比高于對照組(P<0.05)，2組性別、年齡、吸煙史、病程、家族遺傳史、合并癥、基礎疾病、FAB分型等比較差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。本研究經醫院倫理委員會批準(20180627145)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 復發組與對照組AML患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合“成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版) ”[5]中對于AML的診斷標準；②首次診斷AML，且既往未接受過相關藥物治療；③年齡 18～60歲；④患者經過誘導治療后療效判定為病情緩解。(2)排除標準：①伴有其他惡性腫瘤疾??；②嚴重的肝腎功能異常；③治療過程中出現嚴重不良反應；④長期免疫抑制劑、細胞毒性藥物使用病史。

1.3 誘導治療方案 根據文獻[5]中相關推薦，首選方案為注射用鹽酸阿糖胞苷(Ara-C，海正輝瑞制藥有限公司)100～200 mg·m-2·d-1靜脈滴注7 d，注射用鹽酸柔紅霉素(DNR，海正輝瑞制藥有限公司)60～90 mg·m-2·d-1靜脈滴注3 d，二者用量根據患者病情進行調整。如患者誘導治療后緩解則采用標準劑量Ara-C(3 g/m2，1次/12 h，每個療程6 d，共計3～4個療程)維持治療，條件符合患者在獲得緩解后可以接受Allo-HSCT。

1.4 觀測指標與方法

1.4.1 隨訪情況：患者完成治療后進行為期2年隨訪，主要通過電話隨訪及患者定期到醫院復查。電話隨訪每周進行1次，醫院復查根據患者病情動態調整時間，統計隨訪期間無復發生存時間(relapse-free survival，RFS)。

1.4.2 實驗室相關指標檢測：(1)血常規。治療前清晨抽取患者空腹靜脈血7 ml，采用BC-5000型全自動血細胞分析儀及配套試劑(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司生產)檢測中性粒細胞絕對值(N)、血小板計數(PLT)。(2)凝血功能。上述靜脈血，采用C2000-A型全自動凝血分析儀及配套試劑(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司生產)檢測凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白酶原(Fib)。(3)基因突變。采用二代測序(NGS)檢測，上述靜脈血3～4 ml并提取單個核細胞，而后提取細胞內DNA制備全基因組文庫，依托Ion Torrent測序平臺中血液惡性疾病相關的基因情況，對患者外周血單個核細胞中的目標區域PCR富集和高通量平行測序，檢測FLT3-ITD、NPM1、CEBPA及C-KIT基因突變情況。

1.4.3 WT-1 mRNA表達量檢測：留取患者骨髓標本后使用TRIzol reagent 試劑盒(美國ABI公司)提取總RNA；RNA與qRT-PCR引物(WT-1 引物序列：上游引物5'-GATAACCACACAACGCCCATC-3' ；下游引物5'-CACACGTCGCACATCCTGAAT-3')混合后使用7500熒光定量 PCR 儀(美國ABI公司)反向轉錄到cDNA；通過將cDNA、反應酶及TaqMan探針[探針序列：5'-(FAM)CTCCAGGCACACGTCGCACATCCTG(TAMRA)-3']組成qRT-PCR反應體系后加入Step-One Plus Detection定量PCR(美國ABI公司)中進行反應。PCR反應混體系(20 μl)：預混液10 μl， cDNA 1 μl， 引物1 μl，TaqMan探針0.25 μl，而后加蒸餾水配齊；反應過程：預變性95℃、30 s，變性95℃、3 s，退火60℃、30 s?？偣策M行40個循環。采用2-ΔΔCt法，以GAPDH(上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3')為內參，計算誘導治療前后WT-1基因mRNA的表達量，而后計算WT-1 mRNA表達量差值=治療前WT-1 mRNA表達量-治療后WT-1 mRNA表達量，WT-1 mRNA表達量比值=治療后WT-1 mRNA表達量/治療前WT-1 mRNA表達量，以評估患者治療前后WT-1 mRNA表達量動態變化情況。

1.5 療效評價及復發判定標準 (1)緩解標準[6]：①完全緩解(CR)：a.無白血病癥狀體征；b.骨髓原始細胞 <5%，紅系、巨核系正常；c.無 Auer 小體；d.無髓外白血??；e.外周血無白血病細胞，N≥1.5×109/L，PLT≥100×109/L；f.脫離紅細胞輸注，達到上述所有標準記為完全緩解；②形態學CR：符合①標準中的a、b、c、d項標準，伴不全血象恢復(外周血N﹤1.0×109/L 或PLT﹤100×109/L) ；③部分緩解(PR)：骨髓中原始細胞較初始檢查減低至少50%視為部分緩解。(2)復發標準：根據文獻[7]中說明，將病變細胞或骨髓原始細胞超過5%(除外其他原因)或髓外出現病變細胞浸潤定義為疾病復發。

2 結 果

2.1 2組實驗室相關指標比較 復發組FLT3-ITD突變(+)占比高于對照組，治療前后WT-1 mRNA差值低于對照組，而治療后WT-1 mRNA、治療前后WT-1 mRNA比值高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 對照組與復發組AML患者實驗室相關指標比較

2.2 AML復發的相關因素COX回歸分析 以是否復發為因變量(1=是，0=否)，RFS時間為時間變量，表1、2中P<0.05項目作為自變量(Allo-HSCT：1=否，0=是；危險度分級：1=低危，2=中危，3=高危；FLT3-ITD突變：1=陽性，0=陰性；治療后WT-1 mRNA、治療前后WT-1 mRNA差值、治療前后WT-1 mRNA比值取實測值)進行COX回歸分析，結果顯示，治療前后WT-1 mRNA比值高、危險度分級高是AML患者復發的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 AML復發的相關因素COX回歸分析

2.3 AML患者復發預測的ROC曲線分析 根據COX分析結果，以治療前后WT-1 mRNA比值建立AML患者復發的預測曲線，結果顯示，治療前后WT-1 mRNA比值預測AML患者復發的曲線下面積(AUC)為0.861，95%CI0.757～0.966，Cut-off值0.363，敏感度為0.545，特異度為0.966，約登指數為0.511,預測準確率為85.00%，見圖1。

圖1 治療前后WT-1 mRNA比值對AML患者復發預測的ROC曲線

3 討 論

長期臨床觀察發現，約80%的AML患者可以通過Ara-C+DNR/去甲柔紅霉素誘導治療方案獲得緩解，但絕大部分患者因為疾病復發導致的死亡，是影響AML緩解后患者預后的主要因素[8]。Przespolewski等[9]研究指出，AML患者復發后再次使用標準治療方案治療療效不顯著，而早期針對可能復發的患者進行Allo-HSCT或靶向治療等方案是延長患者生存期限的關鍵。故目前臨床上針對AML復發的預測模型研究較多，也為臨床治療提供了較好的參考價值，目前AML復發的預測模型尚需要進行大量研究進一步完善，提升模型的預測效能[10]。

在既往研究中，AML初診并經過治療后獲得CR的患者2年復發率為26%～60%[11-12]，而本研究復發患者占比處于此區間的較低值，這可能與本研究中患者進行Allo-HSCT占比較高(37.93%)有關，可能是降低復發率的關鍵原因。而后通過單因素分析發現，2組患者危險度分級、FLT3-ITD突變情況及WT-1表達情況存在顯著差異。危險度分級是目前國內外各AML診治指南中對于AML疾病預后判定的關鍵因素之一[13]，而危險度分級標準也是經過大量臨床研究總結所指定的標準，也是AML患者制定治療方案的主要參考因素之一。本研究中復發患者AML高危占比相對較高，說明危險度分級還可以作為判定復發的參考指標之一，是對之前研究的補充。而對于FLT3-ITD突變來說，首先其是AML患者被判定為高風險的因素之一[14]；其次，研究發現FLT3-ITD突變在AML患者中發生率高達20%～30%，盡管約70% FLT3-ITD突變患者經過治療后會發生CR，但大多數患者會最終復發并發生耐藥[8, 15]。FLT3-ITD突變可能是影響患者復發的重要因素，但其具體作用機制還有待進一步研究進行探討。WT-1在人體內扮演了轉錄抑制因子的角色,作為目前發現的癌細胞分化的關鍵基因，在多個研究中已經證實其與惡性腫瘤疾病之間的關系。在血液系統惡性疾病的相關研究中則指出，HOTAIR/miR-20a-5p/WT-1通路作為AML發生過程中的關鍵信號通路,其發生的反應過程可以直接促進AML病情進展，同時還可以誘導血液中的異常細胞發生耐藥，從而導致AML患者療效及預后達不到預期目標，而WT-1作為其中的關鍵因子，在疾病發生及發展過程中起到了不可替代的作用[16-17]。WT-1首先可以抑制IGF-Ⅱ、PDGF-A、GM-CSF、TGF-β等造血干細胞正常分化基因的表達，從而在早期分化階段與調控骨髓內原始造血細胞的生長，導致干細胞分化被影響，從而影響AML患者病情進展[18-19]；其次WT-1發生突變,還可以與EGR-1位點結合起到轉錄阻遏物的作用,導致細胞過度增殖而發生異常。本研究發現，治療后2組患者WT-1 mRNA表達較治療前顯著下降，說明誘導治療方案對WT-1的表達可以產生顯著的影響，這一結果與Mehralizadeh等[20]的研究一致。但2組患者治療前WT-1 mRNA并無顯著差異，而治療后復發組WT-1 mRNA明顯較高，提示治療后WT-1 mRNA表達量與復發有一定關系，其具體作用機制尚需要進行相關基礎實驗予以證實。

本研究通過COX回歸分析將Allo-HSCT、FLT3-ITD突變、治療后WT-1 mRNA表達量及治療前后WT-1 mRNA表達量差值等相關因素排除，分析原因如下：(1)Allo-HSCT在所有患者中占比仍相對較低，樣本量較少可能導致結果出現偏倚；(2)有研究提示，FLT3-ITD突變與WT-1基因表達之間存在相關性，同時之前闡述的AML患者中FLT3-ITD突變發生率也相對較低，在二者共同作用下削弱了FLT3-ITD突變與AML患者復發相關的獨立性，故被排除獨立相關因素；(3)基線WT-1 mRNA表達量對治療后此基因表達也存在顯著影響，而計算治療前后差值相較于比值對于基線資料影響的效果較差，故上述2個指標均成為復發的獨立影響因素。最后建立的治療前后WT-1 mRNA比值預測AML復發的ROC曲線說明此指標對于AML患者復發具有一定的預測價值。而此指標預測特異度較好，敏感度則需要進一步加強，故可以作為預測模型中的串聯指標提升模型的預測效能。

綜上，WT-1 mRNA動態表達對于AML患者復發具有一定的臨床價值，但本次研究具有以下幾點不足：(1)本研究為單中心小樣本量研究，結果出現偏倚的可能性較大；(2)本研究為臨床研究，對于其中多個基因的具體作用過程是建立在既往研究基礎上所得，所闡明的作用過程可能不完全，需要進一步進行基礎研究探討。故今后在開展多中心、大樣本量研究探討WT-1 mRNA與AML患者復發關系及具體作用過程的同時，還應嘗試將其運用于AML患者預測綜合模型構建中，并進一步探討綜合模型的效能。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼：提出研究思路，設計研究方案，課題設計，論文撰寫，論文修改；徐麗：提出研究思路，設計研究方案，論文審核；艾克拜爾·阿布都熱衣木：實施研究過程，資料搜集整理；努爾阿米娜·伊明尼亞孜：進行統計學分析