外源硒對冬蟲夏草耳型菌核的硒含量及硒形態的影響

田宗旺 李 想 劉彥威

（河北工程大學，河北邯鄲 056107）

冬蟲夏草自古以來就是我國傳統名貴中藥，與人參、鹿茸并稱為“中藥三寶”，實則為中國被毛孢真菌。硒（Selenium，Se）是元素周期表第34號元素，是一種非金屬元素，性質介于硫元素和碲元素之間，最初被視為對人體有害的元素。我國直到20世紀60年代對克山病的防治研究才發現硒對人體有益，是人體不可缺少的微量元素[1]。硒還是抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶、代謝酶硫氧還蛋白還原酶、甲狀腺激素激活酶和碘甲狀腺原氨酸5?去碘酶等多種酶的重要組成部分[2?4]。目前富硒方式主要靠植物、動物、微生物或人工合成。區別于動物和植物富硒，微生物富硒具有生產周期短，產量高，受環境影響小，操作簡單，硒含量和硒轉化率高，成本低廉等諸多優勢。

筆者通過添加外源硒（Na2SeO3）培養冬蟲夏草耳型菌核，探究冬蟲夏草生長過程中富硒情況以及最終的硒形態，旨在為更全面地評價冬蟲夏草耳型菌核富硒水平，并為富硒食品開發和其他相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試主要材料

冬蟲夏草菌株（邯鄲市禽病預防控制中心分離鑒定）；在淺層靜止培養法[5?6]的基礎上，配制質量濃度為10 g/L的亞硒酸鈉（Na2SeO3）溶液，分別添加0μL、600μL、900μL、1 200μL、1 500μL、1 800μL、2 100μL、2 400μL、3 000μL、4 500μL和6 000μL于培養基中，對應培養基中的Na2SeO3質量濃度為0 mg/L，4 mg/L，6 mg/L，8 mg/L，10 mg/L，12 mg/L，14 mg/L，16 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L。每個質量濃度設3個重復。將培養基置蒸汽滅菌柜中121℃滅菌30 min。待完全冷卻至室溫后按質量分數為2%接種量接種試驗菌種。18℃靜止培養5個月20 d。得到的冬蟲夏草耳型菌核經真空冷凍干燥，超微粉碎后作為試驗樣品。

1.2 供試主要試劑

消解所用化學試劑均為優級純，購于國藥集團。Tris/HCl，鏈霉蛋白酶E購于北京索萊寶科技有限公司。硒標準品購于sigma。除另有注明，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的二級水。

1.3 儀器和設備

原子熒光光譜儀（配硒空心陰極燈）Kylin S18（北京吉天儀器有限公司）；天平BSA124S（德國Sartorius公司）；電熱板DRB4 030 A（冠森生物科技有限公司），MARS6微波消解儀（美國CEM公司）配聚四氟乙烯消解內罐；Flexar Binary液相色譜儀（美國PerkinElmer公司）；NexIon 300DICP?MS（美國PerkinElmer公司）；高速離心機400R（美國Thermo公司）

1.4 硒含量標準溶液的制備

參照GB 5009.93-2017[7]做標準曲線，如圖1所示。

圖1 硒含量標準曲線

1.5 試樣消解

總硒含量測定消化方法參照GB 5009.93—2017[7]，無機硒含量測定消化方法參照GB 1903.22-2016[8]微波消解步驟。

硒形態測定消化采取酶解法：稱取約0.05 g的樣品于聚四氟乙烯管中，加入10 mL 50 mol/L的Tris/HCl緩沖液和10 mg鏈霉蛋白酶E。旋渦振蕩器混合均勻后，將聚四氟乙烯管放入微波消解器。萃取程序如下：先用時10 min上升至40℃，保持60 min，微波功率為160 W，然后再用時5 min上升至45℃，保持20 min，微波功率為200 W。微波萃取結束后，將樣品倒入15 mL塑料離心管，以8 000 r/min離心3 min，過0.45μm濾膜，上機備用。

1.6 硒含量分析參數

儀器參數：總燈電流70 mA，輔陰極燈電流35 mA，光電倍增管負高壓270 V，原子化高度8 mm，載氣流量300 mL/min，屏蔽氣流量800 mL/min。

進樣泵參數：步驟一，時間0 s，A泵轉速1 500 r/min，B泵轉速0 r/min；步驟二，時間27 s，A泵轉速100 r/min，B泵轉速120 r/min。

測量條件：測量方式為標準曲線法，讀數方式為峰面積，延遲時間1 s，讀數時間15 s，加液時間8 s，進樣體積2 mL。

硒含量計算公式參照文獻[7]。

富硒率=有機硒含量（μg/g）×平均干燥質量（g）/外源硒添加量（μg）×100%

1.7 硒形態分析參數

HPLC條件：Hamilton PRP?X100陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10μm），流動相為5 mmol/L檸檬酸溶液（pH 4.7，10%氨水調節），流速1.5 mL/min，進樣量50μL。

ICP?MS條件：RF功率1 300 W，等離子氣（Ar）流速15 L/min，反應氣（CH4）流速0.8 mL/min，Rpq值0.6，霧化氣流速1.0 L/min。采集80Se同位素數據。

2 結果與分析

2.1 冬蟲夏草耳型菌核培養結果及富硒情況

培養的冬蟲夏草耳型菌核干燥后質量如表1。測得硒標準曲線的方程為Y=56.547X+0.567，R2為0.999，表明線性關系良好。將各樣品測得的熒光強度值代入標準曲線方程，得出總硒和無機硒含量（表2）。

表1 冬蟲夏草耳型菌核干燥后質量

表2 冬蟲夏草耳型菌核富硒情況

由表2可以看出，外源硒添加的質量濃度在4~16 mg/L，隨著質量濃度的遞增，耳型菌核中的總硒含量隨之遞增。添加的質量濃度為16 mg/L時，耳型菌核富硒率最大，為23.326 6%，無機硒質量分數為0.046 8 mg/kg。外源硒質量濃度越高，冬蟲夏草耳型菌核中有機硒富硒率越高，但當外源硒質量濃度為20 mg/L時，富硒率下降至17.813 9%，表明外源硒添加的質量濃度大于20 mg/L會抑制冬蟲夏草菌對硒的富集。國標GB 1903.22—2016規定富硒食用菌粉，總硒質量分數為18~400 mg/kg，因此，對照表2可知，外源硒添加的最佳質量濃度為10 mg/L，該質量濃度下，耳型菌核的有機硒質量分數和富硒率相對較高。由于硒添加30 mg/L和40 mg/L嚴重抑制其生物量，未納入表2統計。

圖2 硒標準品離子色譜圖

2.2 硒形態測定分析

根據圖3看出，樣品中一共含有7種形態硒，1.394 4 min，1.528 8 min，1.747 2 min，2.536 8 min，3.427 2 min，4.720 8 min，5.560 8 min處出現峰值，對比硒標準品峰圖可以確定樣品中對應的硒形態分別為硒代胱氨酸、未知硒形態、甲基硒代半胱氨酸、四價硒、硒代蛋氨酸、未知硒形態、六價硒。其中有機硒標準品中硒代乙硫氨酸出峰時間在12 min左右，而樣品在12 min沒有峰，說明冬蟲夏草耳型菌核中沒有硒代乙硫氨酸。

圖3 樣品離子色譜圖

利用單點校準公式作標準曲線，通過峰面積代入公式即可計算原始質量分數，再通過稱樣量和定容體積可以計算最終質量分數。由表3可以看出，有機硒中硒代胱氨酸，甲基硒代半胱氨酸，硒代蛋氨酸最終質量分數高，有機化程度高，四價硒和六價硒最終質量分數低，與國標方法原子熒光光譜測總硒和無機硒的結果一致。通過酶解提取到的蛋白態和無機態有損失，另外還有一些未知蛋白態以及一些硒糖類。

表3 冬蟲夏草耳型菌核硒形態

樣品離子色譜圖與DENG等[9]譜圖樣品出峰順序一致，出峰時間也大致相同，查閱相關文獻[10?11]推測1.528 8 min和4.720 8 min時間出峰樣品分別為硒代半胱氨酸和N?乙酰?硒代蛋氨酸。

3 小結與討論

微生物富硒是在代謝過程中將無機硒插入到蛋白質的二硫鍵而引起結構弱點，實現從無機硒到有機硒的轉化。JI等[12]發現硒質量濃度會影響菌絲生物量，與無添加硒培養基比較，低質量濃度的硒顯著促進菌絲的生長。ZHANG等[13]設置20～80 mg/L四個梯度質量濃度深層發酵冬蟲夏草，采用原子吸收光譜法測得平均富硒質量分數為900μg/g，1 040μg/g，1 709μg/g，1 552μg/g。筆者發現在0~20 mg/L外源硒質量濃度內總硒質量分數最高為631 mg/kg，當外源硒質量濃度在4~16 mg/L，冬蟲夏草富硒率維持在21%以上，但當質量濃度為20 mg/L時富硒率降為17.812 9%。研究結果表明，添加硒不能促進菌絲成長，可能是因為采用的是淺層靜止的培養方法和人工復配的培養基，培養基、培養方式和檢測方法有別于前人研究，另外不同菌株的富硒水平也存在差異，具體原因還有待進一步研究。

BHATIA等[14]利用HPLC?ICP?MS方法檢測富硒雙孢蘑菇，模擬胃腸道提取硒，測得硒的形成以硒代蛋氨酸為主，占檢測物種總數的73%，以及一些其他被氧化的硒物種存在；另一方面，只有2%的樣品以硒（IV）形式存在于無機硒中；在胃腸消化過程中產生的其他一些低分子量硒化合物（占色譜硒含量的25%）仍未鑒定。研究中的富硒冬蟲夏草耳型菌核無機硒含量較低，作為富硒食品更安全，品質也更高。

對于硒形態測量，NEHZATI等[15]利用高能熒光檢測X射線吸收光譜法測定硒形態，建立硒代氨基酸光譜圖，且克服了復雜混合物硒形態形成的一些缺陷，同時證明硒代氨基酸的光譜與它們的硫同屬物有很強的相似性，X射線吸收光譜也存在不能區分元素價態的缺點。筆者采用HPLC?IPC?MS法分析富硒冬蟲夏草耳型菌核硒形態，對比標準譜圖結果準確，而兩種未知硒形態還需進一步確定研究。