紅色紅菇Russula rosea微生物菌群鑒定及分析

李史儀 陸顯格 魯國東 余文英*

（1福建農林大學園藝學院，福建福州 350002；2福建農林大學生命學院，福建福州 350002；3福建農林大學植物保護學院，福建福州 350002）

紅色紅菇Russula rosea，是一種純天然的大型珍貴野生食用菌，夏秋季多群生或散生于冷杉針闊混交林地上[1]。紅色紅菇營養豐富，富含多種人體必需常量元素和微量元素，具有高蛋白、低脂肪的特點[2]，有較高的食用及藥用價值。紅菇內含有蛋白質、多肽、多糖、甾類、萜類、有機酸和酚類等多種生理活性物質，可為農業、林業病蟲害的生物防治提供研發資源，但目前尚不能人工栽培。國內外有不少關于野生紅菇的報道，如我國野生紅菇的生態、資源、分類、分離純化和應用研究，紅菇的化學成分分析、子實體多糖提取等，為進行人工栽培研究提供了科學依據。但到目前為止，由于紅菇生長所需的條件及生理的特殊性，國內外至今也未見其人工栽培成功的報道[3]。

當今食用菌微生態多樣性研究已成為熱點。研究微生物群落多樣性，主要采取傳統微生物的分離及分類鑒定方法（主要是平板分離、形態學的觀察）與現代分子生物學（主要采用高通量測序技術等）相結合手段[4]。筆者采用平板分離培養方法和現代高通量測序技術相結合手段，分析紅菇生境土壤的微生物種群及特征，旨在揭示紅菇生境微生物優勢菌群等特征，為人為大幅度提高紅菇產量和品質提供技術支撐，實現紅菇大規模以及大范圍人工栽培。

1 材料與方法

1.1 材料采集及處理

將采集的福建省古田縣紅色紅菇新鮮子實體（去除表面泥沙雜物）及子實體根際土帶回實驗室后，分別分成兩份于4℃冷藏保存備用。其中一份用于直接分離培養微生物，另一份用于后續宏基因組的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離

紅菇子實體微生物分離：分離部位選取菌柄中間的組織塊，并采用添加腐殖土PDA培養[5]。根際土微生物分離：真菌用PDA培養基（添加氯霉素以去除細菌的干擾），細菌用NA培養基。

1.2.2 總基因組DNA提取及高通量測序

子實體基因組提取參照YU等[6]方法，子實體根際土的微生物基因組提取參照余文英等[7]方法。分別以子實體基因組或根際土的基因組為模板，采用真菌特異引物對ITS1F（TCCG TAGG TGAA CCTG CGG）和ITS4（TCCTCCGC TTAT TGAT ATGC）進行PCR擴增真菌ITS1?ITS4區域。以宏基因組為模板，采用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴 增 細 菌16 sRNA的V3—V6高變區域。PCR條件為：95℃預變性5 min，95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共15個循環，最后72℃延伸7 min，4℃保存。真菌和細菌PCR擴增片段分別用Illumina HiSeq高通量測序。

1.2.3 分離培養細菌16sRNA、真菌ITS片段的PCR擴增，克隆測序

將所分離純化的子實體及根際土壤微生物參照余文英等[7]方法提取DNA。以提取的基因組為模板，真菌采用引物對ITS1F和ITS4 PCR擴增ITS1—ITS4片段，細菌采用細菌的通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）PCR擴增16 sRNA片段。PCR反應條件同1.2.2。將PCR產物電泳純化后克隆到大腸桿菌，將陽性克隆菌液交由上海生工生物工程有限公司測序，最后將測序的序列與NCBI數據庫比對，鑒定。

1.2.4 測序數據處理

將Illumina HiSeq高通量測序的結果在BioEdit 7.0.8中手動更正，去除singleton的物種級操作分類單元OTU（Operational Taxonomic Untis），以97%的序列相似性聚類為OTU進行物種定界。利用NCBI，Silva，UNITE數據庫比對OTU[8?9]，當比對結果相似度≥90%則鑒定到屬，相似度在80%~89%鑒定到科[10]。對可培養菌的陽性克隆測序序列的結果用BioEdit編輯，相似度≥97%且堿基差異5個以內的歸為一個種。

1.2.5 數據分析

采用VENNY方法對主要微生物菌群（Core microbiome）進行在線分析（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。通過spearman檢驗方法對選取所有樣本絕對豐度前10的OTU進行微生物之間的互作關系（NetWork）分析，對spearman計算所得結果過濾掉P值大于0.05的或相關值|R|＜0.4。

2 結果與分析

2.1 紅色紅菇子實體微生物多樣性分析

通過高通量檢測，紅色紅菇子實體的真菌和細菌的OTU，分別為369.67及109.33。進一步分析了真菌及細菌的chao1、shannon指數，結果表明子實體微生物無論是物種豐富度還是生物多樣性都比較高，而真菌的物種豐富度比細菌高，但是細菌的多樣性比真菌高（表1）。

表1 子實體中OTU及alpha多樣性指數

2.2 紅色紅菇子實體微生物組成分析

對紅菇的子實體進行了真菌和細菌的微生物擴增子高通量測定，從而分析真菌和細菌的組成。

2.2.1 真菌核心菌群及優勢種群分析

子實體樣本的真菌種類，按0.5%的閾值，包括5門，15綱，54目，75科，覆蓋157屬，通過韋恩分析（Venns）核心菌群，發現真菌屬水平上3個子實體樣本中有83個共有屬，占全部真菌屬的22.6%。進一步對占比前20的真菌屬進行Venns分析，發現3個子實體樣本中，有16個共有屬即子實體的核心真菌（Core microbiome），分別為Russula，Chrysosporium，Mortierella，Fusarium，Trichoderma，Aspergillus，Thielavia，Chaetomium，Stachybotrys，Saitozyma，Co?niochaeta，Tuber，Geminibasidium，Trechispora，Podos?pora，Alternaria（這些為核心菌群）。其中絕對優勢真菌屬為紅菇屬Russula，占比83%；其次是金孢菌屬Chrysosporium，占比2.3%，是除紅菇屬外的優勢真菌屬（圖1）。

2.2.2 細菌核心菌群及優勢種群分析

紅色紅菇子實體細菌種類按0.5%的閾值已鑒定3門，6綱，11目，20科，104屬。Venns分析核心菌群，在細菌種水平上3個子實體樣本有11個共有種（Core microbiome），分別為Duganella，Pseudomo?nas，Luteibacter，Stenotrophomonas，Pandoraea，Burk?holderia-Paraburkholderia，Mucilaginibacter，Rhizobi?um，Variovorax，Dyella，Acidibacter。另外占比前20的細菌屬進行分析，發現3個子實體樣本有7個共有屬：Duganella，Pseudomonas，Luteibacter，Burkhold?eria-Paraburkholderia，Mucilaginibacter，Rhizobium，Dyella（這些屬為優勢屬）。其中杜檊氏屬Duganella和假單胞菌屬Pseudomonas為絕對優勢屬，占比分別達32%和20%（圖2）。

圖2 紅色紅菇子實體分離培養的前20種細菌屬組成

2.3 紅色紅菇子實體微生物菌群之間的互作分析

2.3.1 真菌菌群之間的互作分析

OTU_1，OTU_2，OTU_3是紅色紅菇。表2中紅色紅菇OUT_1與OUT_6、OTU_13（g_Chrysosporium；s_Chrysosporium_undulatum）和OUT_2、OTU_3（Rus?sula_rosea）呈負相關關系，其他均為正相關，正相關最強是OUT_9。紅色紅菇OUT_1與OUT_6、OUT_13（金孢屬Chrysosporium）負相關外，與其他屬均呈正相關。

表2 紅色紅菇子實體豐度前10 OTU_中真菌微生物菌群之間的相互關系

2.3.2 細菌微生物菌群之間的互作分析

OTU_2和OTU_6是紅色紅菇子實體中的優勢細菌屬，然而這兩種優勢細菌呈負相關，相關系數達?0.96。由表3可知，OTU_2與OTU_19、OTU_9、OTU_3、OUT_6呈負相關關系，但與OUT_7正相關。OUT_6與OUT_7負相關，與OTU_19、OTU_9、OTU_3正相關?？梢娫诩t色紅菇子實體中的微生物菌群中，以Duganella為優勢的OUT_6和OTU_19、OTU_9，OTU_3處于一種功能群；而以Enterobacteriaceae為優勢的OTU_2、OUT_7則處于另一類功能群。

表3 紅菇子實體豐度前10 OTU中細菌微生物菌群之間的相互關系分析

2.4 紅色紅菇子實體及子實體根際土壤微生物的分離

將從子實體及根際土分離純化的微生物克隆測序的序列與NCBI數據庫比對，鑒定分離培養菌的種類。由表4可見，紅色紅菇子實體中分離并鑒定3株真菌，其中2株為木霉屬Trichoderma，另1株為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis，但是沒有分離到R.rosea。子實體根際土壤中分離并鑒定的5株真菌，其中1株只比對到目，為被孢霉目Mortierellales；另外4株鑒定到屬，分別為Aspergillusparvulus，Chaunopycnissp.，Apiotrichum porosum，被孢霉Mor?tierellalessp.。從菌根土壤中分離并鑒定出細菌2個屬，分別為Burkholderiasp.和Paraburkholderiasp.這些真菌和細菌分別為R.rosea菌根根際土壤的優勢菌株。

表4 紅色紅菇子實體及根際土壤中分離鑒定的真菌、細菌菌株

3 小結與討論

紅菇及其共生樹紅椎CastanopsishystrixMiq.等所在生態系統影響著子實體與菌根，及其菌根根際土壤的微生物活動，因此，研究紅菇微生物菌群多樣性對其野生資源的保護及可持續發展具有重要現實意義。

首次通過高通量測序方法探討了紅色紅菇R.rosea微生物多樣性，初步了解R.rosea菌群種類組成和數量，子實體中真菌比細菌種類多。子實體真菌菌群中，絕對優勢屬為紅菇屬Russula，優勢種為R.rosea，其次是金孢菌屬Chrysosporium（是除紅菇屬外的另一優勢真菌屬）；子實體細菌菌群中，Duganella和Pseudomonas為絕對優勢屬，Burkholderia-Paraburkholderia等為優勢屬。另外，在福建省古田縣首次發現了Tuber，但是在紅菇林中并沒有采集到Tuber子實體，此項工作還有待進一步研究。在R.ro?sea菌群中，TOP10真菌OTU中，R.rosea與大部分OTU都成正相關，而與Chrysosporium_Chrysosporium呈負相關；TOP10細菌OTU中，發現呈拮抗作用的兩種功能群，一種以Enterobacteriaceae為代表，另一種以Duganella為代表。R.rosea微生物分析對促進紅菇子實體形成有重要作用，也為分離這些有益微生物并施入土壤提供可能，這些都將為提高紅菇產量提供理論依據。

紅菇屬真菌為外生菌根真菌，分離培養困難，目前雖有紅菇屬分離成功的報道，但獲得真紅菇屬菌絲體的極少[5，11?12]，而且目前還無法人工栽培紅菇[13]。劉斌[11]等培養觀察紅菇的分離物時發現，紅菇菌肉的生殖菌絲是由球狀胞（孢囊狀菌絲）組成，埋在管狀聯絡菌絲中，再生能力較低，因而采用菌肉組織作為分離菌株材料成功率低。因此紅菇分離部位應選取菌柄中間的組織塊。蔡小玲等[5]開展野生紅菇的分離培養試驗，采用PDA添加腐殖土培養基培養，分離培養正紅菇子實體組織獲得正紅菇菌絲，并用該培養基擴大培養和保存。

筆者研究遺憾之處在于沒有從子實體中分離培養出紅菇菌株，僅培養出Trichoderma（木霉屬）和Pestalotiopsis（擬盤多毛孢屬）；有可能是培養基未添加紅菇所需的相關生長因子，即沒找到合適的培養基，有必要進一步篩選合適的培養基。另外，從高通量測序也表明Trichoderma和Pestalotiopsis這兩種微生物是R.rosea的優勢菌，或者它們也和白木耳的伴生菌一樣，有可能是紅菇的伴生菌，該種推測是否準確還有待進一步研究。

紅菇菌株未能成功分離，還有可能是在培養時紅菇菌絲生長比較慢，木霉屬和擬盤多毛孢屬這兩種真菌在現有的培養基中長勢比紅菇菌絲強，搶占了生長的時空生態位。因此可以考慮添加特異的抑制劑把快速生長的菌除去，生長比較慢的紅菇菌絲才有可能生長，這也有待于進一步研究。

目前微生物菌劑備受關注，但國內對于紅菇菌劑研究的報道很少，這可能也是國內紅色紅菇無法仿生栽培的原因之一。黃福常等[14]發現紅菇可以在添加有正紅菇菌劑RL的椎苗根際土壤中繁殖；趙志鵬[15]研究21種外生菌根菌在溫濕度和寄主等不同生態條件下的耐受度以及它們之間的拮抗作用時，篩選出固體菌劑S.grevillei，從菌根土壤中培養出真菌Aspergillusparvulus，Chaunopycnissp.，Apiotri?chum porosum，Mortierellalessp.；菌根土壤中培養出細菌Burkholderiasp.，Paraburkholderiasp.，這些都是菌根土壤高通量分析出的優勢菌。另外對菌根土壤分離并鑒定出的4個真菌和2個細菌優勢菌株，由于培養基及培養條件等的限制，培養的菌株有限，尚待進一步鑒定到種的水平。張彤彤等[16]報道菌根微生物影響根際土磷和鉀等礦質元素的吸收，另外，根際土酸堿平衡發生改變，pH的變化會進一步影響根際土微生物群落的變化，從而影響共生樹木對土壤全磷、全鉀養分的吸收。對這些菌應做初步生物學測定，探索其是否促進根系生長以及混合生長，為進一步開發混合菌劑，測試和推廣奠定基礎。添加一些益生菌，可能更有利于菌根的營養吸收和形成，促進紅菇產量，保障利用紅菇自然資源的可持續性。