結(jié)直腸癌不同病理特征患者化療前后循環(huán)腫瘤DNA水平變化及預(yù)后預(yù)測的列線圖模型構(gòu)建

李程，閆柯，霍斌亮，李文翰，趙剛

結(jié)直腸癌是當(dāng)前癌癥死亡主因之一，目前化療仍是晚期結(jié)直腸癌首要治療手段，但5年生存率僅10%左右[1-2]。可靠的評估技術(shù)對改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后、指導(dǎo)制定治療方案、延長患者生存期具有重要作用。臨床研究證實(shí)，基因突變是結(jié)直腸癌發(fā)病的分子生物學(xué)重要驅(qū)動(dòng)機(jī)制，且持續(xù)存在的基因突變可驅(qū)動(dòng)結(jié)直腸癌克隆進(jìn)化[3]。組織活檢是臨床評估腫瘤組織形態(tài)及細(xì)胞克隆進(jìn)化情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其可重復(fù)性差，而液體活檢是近年新興癌癥檢查技術(shù)，同時(shí)中外學(xué)者最新研究表明，腫瘤所釋放的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)與腫瘤組織內(nèi)DNA呈高度一致性[4-5]。基于此，現(xiàn)觀察結(jié)直腸癌不同病理特征患者化療前后循環(huán)腫瘤DNA水平變化，并構(gòu)建預(yù)后預(yù)測的列線圖模型，為臨床完善相關(guān)評估機(jī)制提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年4月—2019年9月陜西省人民醫(yī)院腫瘤外科收治的結(jié)直腸癌患者144例作為觀察組，同期結(jié)直腸良性瘤患者72例作為對照Ⅰ組，健康體檢者72例作為對照Ⅱ組。觀察組男83例，女61例，年齡29～73(51.46±9.38)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～25(21.16±1.25)kg/m2；飲食習(xí)慣：喜肥甘77例，喜清淡36例，均衡31例；吸煙105例，飲酒83例。對照Ⅰ組男40例，女32例，年齡27～75(52.58±9.20)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～25(21.21±1.30)kg/m2；飲食習(xí)慣：喜肥甘37例，喜清淡19例，均衡16例；吸煙52例，飲酒40例。對照Ⅱ組男41例，女31例，年齡28～73(50.91±8.34)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～24(21.08±1.28)kg/m2；飲食習(xí)慣：喜肥甘29例，喜清淡22例，均衡21例；吸煙50例，飲酒42例。3組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲食習(xí)慣、吸煙、飲酒等基礎(chǔ)資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY20160325098)，受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組經(jīng)病理檢查確診[6]；TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期；卡氏評分(KPS)>70分；首次確診，入組前未經(jīng)相關(guān)治療；均接受化療；預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；心、肺、肝、腎臟器功能正常。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：存在化療禁忌證者；有惡性腫瘤史；同時(shí)性多原發(fā)性腫瘤。

1.3 化療方法 結(jié)直腸癌患者144例均根據(jù)病理特征常規(guī)選擇XELOX方案或FOLFOX4方案化療，3周為1個(gè)療程，均進(jìn)行3個(gè)療程，化療后隨訪2年，統(tǒng)計(jì)觀察組患者生存情況。

1.4 觀測指標(biāo)與方法

1.4.1 ctDNA水平檢測：以EDTA抗凝管采集3組人員清晨空腹肘靜脈血4 ml，顛倒混勻，移至離心管，并加等體積磷酸鹽緩沖液，常溫離心，去除上清液，沉淀置于裂解緩沖液內(nèi)，37 ℃水浴1 h；移液管取蛋白酶K 20 μl加入1.5 ml微量離心管內(nèi)[范德(北京)生物科技有限責(zé)任公司]，再加溫浴后的標(biāo)本5 μl，加PBS調(diào)容至220 μl，加緩沖液AL 200 μl，振蕩，孵育10 min(56℃)，加乙醇200 μl，混勻，移液槍(上海恒奇儀器儀表有限公司移液槍)移取混合液至DNeasy Mini spin column，離心，棄上清液，將DNeasy Mini spin column移至2 ml新收集管，加緩沖液AW1，離心1 min(8 000 rpm)，棄采集管，并移至2 ml新收集管，加適量AW2，離心3 min(14 000 rmp)，棄采集管，再次移至新微量離心管(2 ml)，移液槍取緩沖液AE 200 μl加入DNeasy membrane，室溫孵育1 min，離心1 min(8 000 rpm)，洗脫，收集ctDNA。取樣本1 μl于260 nm波長紫外線可見光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司UV-5500型)下測吸光度值，參照吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得ctDNA水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組ctDNA水平比較 觀察組、對照Ⅰ組、對照Ⅱ組ctDNA水平分別為(142.58±45.59)μg/L、(78.69±24.76)μg/L和(38.65±11.35)μg/L，3組比較觀察組>對照Ⅰ組>對照Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=229.968/<0.001)。

2.2 觀察組不同病理特征患者化療前/后ctDNA水平比較 不同腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期患者化療前/后ctDNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同組織學(xué)類型患者化療前/后ctDNA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 觀察組不同病理特征患者化療前/后ctDNA水平比較

2.3 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素分析 隨訪2年，144例患者脫落8例，有效隨訪136例，生存54例，病死82例。結(jié)直腸癌患者預(yù)后與性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲食習(xí)慣、不良生活習(xí)慣、化療方案無關(guān)(P>0.05)；結(jié)直腸癌患者年齡≥50歲、腫瘤直徑>5 cm、分化程度低、浸潤深度突破漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期T4、化療前/后ctDNA水平≥142.58/86.59 μg/L者生存率低(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者預(yù)后情況比較 [例(%)]

2.4 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素分析 將表2中P<0.05項(xiàng)目作為自變量(年齡<50歲=1，≥50歲=2；腫瘤直徑≤5 cm=1，>5 cm=2；分化程度低=1，中—高分化=2；浸潤深度未突破漿膜層=0，突破漿膜層=1；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：否=0，是=1；T分期T1～T3=1，T4=2)，預(yù)后(生存=0，病死=1)作為因變量，納入Cox回歸模型，結(jié)果顯示，分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、化療后ctDNA水平均是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的Cox回歸模型分析

2.5 結(jié)直腸癌預(yù)后的列線圖模型構(gòu)建 應(yīng)用Cox回歸模型篩選出的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、化療后ctDNA水平構(gòu)建結(jié)直腸癌患者預(yù)后列線圖預(yù)測模型，一致性指數(shù)為0.892。校正曲線分析顯示，預(yù)測模型預(yù)測病死風(fēng)險(xiǎn)與實(shí)際病死風(fēng)險(xiǎn)吻合度較高，見圖1、2。

圖1 結(jié)直腸癌患者預(yù)后列線圖預(yù)測模型

3 討 論

目前結(jié)直腸癌已成為世界第三大惡性腫瘤[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率約占全球24.3%，且其發(fā)病率在大城市以年均4%～5%的速度遞增[8-9]。但結(jié)直腸癌并非絕對絕癥，其中1/3可預(yù)防，1/3可達(dá)臨床治愈，還有1/3通過有效治療可提升生存質(zhì)量，延長生存期[10]。但如何評估結(jié)直腸癌患者病情轉(zhuǎn)歸，指導(dǎo)完善治療方案是困擾臨床的一大難題。

圖2 結(jié)直腸癌患者預(yù)后列線圖預(yù)測模型的校正曲線

近年隨分子生物學(xué)研究深入，不斷有研究提出基因檢測在腫瘤診斷及病情評估中存在獨(dú)特優(yōu)勢[11-12]。循環(huán)游離DNA是無細(xì)胞狀態(tài)的一種胞外DNA，除少部分來自正常細(xì)胞DNA外，大部分來自腫瘤細(xì)胞。ctDNA相對于組織學(xué)活檢能從循環(huán)血內(nèi)易分離，具有無創(chuàng)、便捷等優(yōu)勢，且ctDNA來自于各處病灶，能為臨床提供實(shí)時(shí)、全面的病情評估信息[13]。Benesová等[14]研究指出，轉(zhuǎn)移性大腸癌患者ctDNA普遍陽性，且水平與患者實(shí)際臨床狀態(tài)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤患者ctDNA呈升高趨勢，且惡性患者升高更顯著，與以往研究結(jié)果一致[15-16]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，化療前后ctDNA水平與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、T分期均有關(guān)系。分析原因可能是：(1)隨腫瘤直徑增大，惡性細(xì)胞增殖活躍，同時(shí)凋亡細(xì)胞增加，而“清道夫”細(xì)胞無法及時(shí)有效清除急劇增加的惡性細(xì)胞及凋亡細(xì)胞時(shí)，直接造成ctDNA顯著升高[17]；(2)T分期較高及突破漿膜層的患者，可能同時(shí)存在多處微小轉(zhuǎn)移灶，而微小轉(zhuǎn)移灶內(nèi)惡性細(xì)胞凋亡、裂解也會(huì)增加外周血ctDNA水平[18]；(3)多項(xiàng)研究已證實(shí)，低分化組織內(nèi)多分布脈管癌栓，而一定程度上脈管癌栓在增加微小轉(zhuǎn)移灶的同時(shí)可影響病灶局部血流供給，導(dǎo)致惡性細(xì)胞凋亡釋放ctDNA入血[19]。上述研究提示，ctDNA可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，或可為臨床提供預(yù)后預(yù)測信息。

相關(guān)研究也指出，結(jié)直腸癌患者預(yù)后是一個(gè)多因素綜合作用的結(jié)果。蔣蘇靜[20]以SEER數(shù)據(jù)庫中698例原發(fā)性十二指腸腺癌患者為研究對象發(fā)現(xiàn)，年齡、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素；韓晶等[21]未發(fā)現(xiàn)年齡與結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)預(yù)后有關(guān)，組織學(xué)類型、TNM分期是此類患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。本研究對化療結(jié)直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)，不同預(yù)后患者間年齡、腫瘤直徑、分化程度等存在差異，但組織學(xué)類型與預(yù)后無相關(guān)性，與上述研究存在一定異同，此特征可能與樣本量選取、病例個(gè)體差異等因素有關(guān)，上述研究均說明單純從病理特征層面可能難以為臨床提供準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測信息。本研究采用Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、化療后ctDNA水平均是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，且化療后隨ctDNA水平增加，病死風(fēng)險(xiǎn)隨之增加。進(jìn)一步構(gòu)建結(jié)直腸癌患者預(yù)后的列線圖預(yù)測模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)头只⒘馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移、T4期單獨(dú)存在時(shí)結(jié)直腸癌患者隨訪期病死風(fēng)險(xiǎn)尚不足10%，而化療后ctDNA水平≥86.59 μg/L單獨(dú)存在時(shí)隨訪期病死風(fēng)險(xiǎn)接近20%。初看此數(shù)據(jù)與臨床不符，主要是因本研究選取病例為晚期結(jié)直腸癌患者，此階段患者病情特征復(fù)雜，往往低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T4期及ctDNA高水平同時(shí)存在，臨床在預(yù)后評估中應(yīng)注重ctDNA水平的檢測。結(jié)直腸癌患者預(yù)后列線圖預(yù)測模型的校正曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致性指數(shù)為0.892，客觀說明此列線圖預(yù)測模型具有較高實(shí)用價(jià)值。

綜上，結(jié)直腸癌患者ctDNA水平與病理特征有關(guān)，且采用列線圖模型預(yù)測此類患者預(yù)后時(shí)ctDNA水平優(yōu)勢顯著，或能成為臨床完善結(jié)直腸癌患者預(yù)后評估機(jī)制的有力補(bǔ)充。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李程：提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，論文撰寫，論文修改；閆柯：實(shí)施研究過程，資料搜集整理；霍斌亮：論文審核；李文翰、趙剛：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，資料搜集整理