青貯發酵飼料中三株乳酸菌的生理特性研究

孫亞楠，李 梅，劉玉龍，任玉，朱朝華，潘立超，任海偉

（蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

0 引言

乳酸菌（LBA） 是一類能夠分解代謝碳水化合物并產生大量乳酸的一組細菌的統稱。乳酸菌可增強動物機體免疫力，提高腸道黏膜免疫，幫助腸道消化，促進生長和繁殖，是一類具有明顯益生功能的“益生菌”，且具有較好的生理特性。在農業、生物飼料、醫藥、食品等領域有廣泛的應用[1-3]。

青貯飼料是反芻動物的重要粗飼料來源，是推動畜牧業發展的主要動力。在青貯飼料的制備過程中，乳酸菌在厭氧條件下發酵產生有機酸，從而迅速降低飼料的pH 值，在較低的pH 值環境下，其他有害微生物的生長會受到抑制，從而延長了飼料的儲存期，減少了青貯飼料中營養物質的消耗和破壞，可以有效提高青貯發酵飼料的品質[4]。許多研究表明，青貯時添加乳酸菌不僅能夠增加青貯飼料的能量和蛋白等營養物質，還可以在青貯過程中產生具有抗菌活性或抗氧化作用的乳酸、乙酸等功能性代謝產物[5-7]。青貯時挑選出繁殖能力快、產酸能力強的精良乳酸菌菌株，是制備精良添加劑的核心，也是青貯最終能成功的重要決定因素[8-13]。近年來，乳酸菌在生物飼料領域的研究顯著增多，謝華德等人[14]研究乳酸菌對象草青貯發酵品質的影響，發現添加LAB 可以改善象草發酵品質，提高象草青貯料的營養。何軼群等人[15]從玉米秸稈飼料中篩選到6 株產酸和抑菌效果良好的乳酸菌，其中植物乳桿菌的產酸性能最好。

3 株乳酸菌在青貯過程中均扮演著重要的角色，其中植物乳桿菌作為一種同型發酵乳酸菌，相比異型發酵乳酸菌，有產酸速率高、青貯飼料中干物質含量損失更少等優勢[11]。戊糖片球菌是青貯過程中的固有乳酸菌菌種，可以顯著提高家禽的飼料轉化率和青貯發酵速率，改善青貯飼料的品質[12]。類干酪乳桿菌RSI 安全，無致病性，在抑制病原菌、調節細胞免疫方面效果顯著，是一株優秀的工業菌株[13]。

因此，對3 株乳酸菌生長特性進行研究，篩選出適合用于青貯的精良菌株，目的在于獲得更具優良生物特性的乳酸菌，以期為更好地在青貯飼料中利用乳酸菌及其開發利用奠定基礎[14-19]。

1 材料與方法

1.1 培養基及試劑

MRS 培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 g，檸檬酸氫二氨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g，磷酸氫二鉀2 g（瓊脂15 g）；加蒸餾水至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

立式電熱壓力蒸汽滅菌器、智能生化培養箱、紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；SBA～40X 型生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所產品；PBH-5 型便攜式酸度計，杭州雷磁分析儀器廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化、純化

供試3 株乳酸菌為蘭州理工大學生命科學與工程學院實驗室所保藏。

（1） 活化。將植物乳桿菌、類干酪乳桿菌和戊糖片球菌3 株乳酸菌接種于MRS 液體培養基表面，在37 ℃的培養箱中培養48 h，當培養基出現渾濁時取出。

（2） 純化。各取0.2 mL 活化后的菌株分別涂布于MRS 固體培養基表面，37 ℃條件下厭氧培養48 h。待單菌落生長，結合菌落形態觀察等綜合鑒定為純菌株，然后作為測試菌種進行純培養。

1.3.2 菌種的培養

以體積分數為1%的接種量[20]將不同乳酸菌在MRS 培養基（液體） 上接種，分別在不同的溫度（20，30，37，42，50 ℃） 和pH 值（3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5） 下培養48 h。每隔3 h 取樣1 次，在波長600 nm 的可見光條件下用分光光度計測其OD值繪制生長曲線，并測定樣品中的乳酸濃度和pH 值。

（1） 菌株的溫度生長試驗。設置5 個溫度梯度（20，30，37，42，50 ℃），在經嚴格滅菌的150 mL的MRS 液體培養基（pH 值為6.5） 上，接種體積分數為1%的活化菌種[20]，置培養箱中厭氧培養48 h。從接種開始每隔3 h 取樣9 mL 于離心管中，分別測定其中的OD 值、pH 值及乳酸濃度。

（2） 菌株的pH 值生長試驗。設置不同pH 值梯度的MRS 液體培養基，pH 值參數分別為3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5。用1 mol/L 的NaOH 和HCl 溶液調節滅菌前的pH 值。在150 mL 經嚴格滅菌處理的MRS 液體培養基（溫度為37 ℃） 上以體積分數為1%的接種量接種活化菌種，置于培養箱中厭氧培養48 h[20]。從接種開始每隔3h 取樣9 mL 于離心管中，分別測定其中的OD 值、pH 值及乳酸濃度。

1.4 數據分析

用Excel 軟件繪制圖表，對不同溫度和pH 值處理的OD 值和乳酸濃度進行分析，從而得到乳酸菌的最適生長條件。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌的生理特性研究

2.1.1 溫度對植物乳桿菌影響

不同溫度下植物乳桿菌中乳酸質量濃度、pH值、OD 值的變化見圖1。

由圖1（a） 可知，植物乳桿菌在20 ℃培養時，9 h 后乳酸質量濃度下降，21～30 h 乳酸質量濃度穩定，產酸速度基本為零，30 h 后乳酸質量濃度開始有緩慢上升；在30 ℃培養時，接種3 h 后開始產生乳酸，3～6 h 產乳酸速度最快，6～33 h 乳酸質量濃度基本穩定，33 h 后乳酸質量濃度開始上升；在37 ℃培養時，3 h 后開始產生乳酸，3～9 h 間產酸速度最快，此后在21～48 h 期間乳酸質量濃度基本穩定，產酸較少；在42 ℃培養時，3～6 h 產酸速度最快，在21～48 h 時，產酸較為平穩；在50 ℃時檢測到的乳酸含量一直很低，可以判定植物乳桿菌在50 ℃不生長。由圖1（b） 可知，菌液的pH 值基本維持穩定，在50 ℃培養時取得樣液的pH 值基本不變，植物乳桿菌在50 ℃時不產生乳酸。且由圖可知pH 值變化與乳酸質量濃度變化相對應，二者呈負相關。由圖1（c） 可知，在20，30，37 ℃時，菌體密度變化情況基本相同，在培養一開始并沒有出現明顯改變，3 h 后細菌進入對數期生長，24 h 后逐漸生長遲緩，達到穩定期；在42 ℃時，乳酸菌對數期為3～12 h，12～48 h 菌體生長到達穩定期，之后進入衰亡期；在50 ℃時OD 值基本保持穩定不變，說明并無乳酸菌生長。

圖1 不同溫度下植物乳桿菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化

綜上所述，當溫度高于50 ℃時該植物乳桿菌無菌群擴增、產酸等生理現象，生命代謝基本停止。該植物乳桿菌可生存的溫度需低于50 ℃，當溫度處于適宜溫度范圍30～37 ℃時，菌體增殖和產酸效應均處于最佳，與茍擁軍、黃玉軍、李相禹等人[21-23]的研究結果相似，最適的發酵溫度均在該范圍內；當溫度高于適宜溫度范圍菌體生長至穩定期所需的時間延長；當溫度低于適宜溫度范圍菌體的發酵過程中乳酸濃度會受到較大影響，在pH 值保持穩定的情況下乳酸被消耗，即乳酸消耗的同時有其他酸類物質生成。

2.1.2 pH 值對植物乳桿菌影響

不同pH 值下植物乳桿菌中乳酸質量濃度、pH值、OD 值的變化見圖2。

圖2 不同pH 值下植物乳桿菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化

由圖2（a） 可知，植物乳桿菌在pH 值為4.5，7.5，8.5 的條件下培養時，主產酸期均為12～21 h，在21～30 h 的培養階段產酸速度減緩，30 h 后乳酸質量濃度基本保持不變，最終乳酸質量濃度在pH 值為7.5，8.5 培養時最大，為1 280 mg/mL，在pH 值為4.5 的條件下培養時次之；在pH 值為5.5，6.5 的條件下培養，3 h 時開始產酸，之后產酸速度減緩，12～27 h 產酸速度增加，在27 h 后乳酸質量濃度保持穩定，在pH 值為5.5 的條件下培養時終產酸質量濃度與在pH 值為8.5 培養時基本相同；pH 值為3.5時，檢測到的乳酸含量一直很低，可以得出植物乳桿菌在此pH 值條件下不生長，36 h 后乳酸質量濃度開始上升。由圖2（b） 可知，在0～9 h 期間，初始pH 值為6.5 培養時pH 值下降最快，pH 值為5.5 培養時次之；初始pH 值為4.5，7.5，8.5 條件下培養時，在12～21 h 期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為3.5 培養時，pH 值基本保持不變。由圖2（c） 可知，初始pH 值為6.5 培養時，3 h 后細菌繁殖迅速，進入對數期生長，6 h 后生長逐漸遲緩，達到穩定期；初始pH 值為7.5 培養時，9 h 后細菌繁殖迅速，進入對數期生長，12 h 后生長逐漸遲緩，達到穩定期；初始pH 值為4.5 培養時，12 h 后細菌繁殖迅速，進入對數生長期，24 h后生長逐漸遲緩，達到穩定期；初始pH 值為5.5 培養時，9 h 后細菌開始大量生長，進入對數生長期，12 h 后逐漸趨于平緩，到達生長穩定時期，30 h 后又開始大量生長，直至36 h 生長遲緩，到達穩定期；初始pH 值為3.5，8.5 的條件下培養時，OD 值一直在緩慢增大，但一直處于較低的水平，說明基本無乳酸菌生長。

綜上所述，隨著發酵時間的不斷延長，整個發酵體系的pH 值不斷降低，最終穩定在pH 值3.5 左右。當發酵體系的pH 值達到穩定值3.5 后，pH 值不再大幅度的變化，即植物乳桿菌在pH 值低于3.5的條件下代謝受到抑制、無乳酸產生、菌體無擴增，菌體在該pH 值條件下無生命特征。菌體的擴增、產酸基本是同時進行的，該植物乳桿菌的最適pH 值為6.5，在此pH 值條件下菌體最快度過遲緩期，最快進入對數期和穩定期。陳境等人[24]的研究發現pH 值6.8 作為最適初始pH 值，可以使植物乳桿菌相關的酶活性增加，促進其生長。M V Leal-Sánchez 等人[25]也報道了植物乳桿菌LPCO 的最適發酵pH 值范圍為4.5～6.5。當pH 值高于或低于6.5 時，菌體的生長速率和產酸效應會出現一定程度的負效應，其程度與pH 值偏離6.5 的幅度呈正相關，該特性與李娜等人[26]報道的pH 值對植物乳桿菌ZJ316 的影響相一致。pH 值對該植物乳桿菌發酵過程的影響規律與文獻報道基本一致，主要差異在它們的酸穩定性，茍擁軍等人[21]報道的果漿發酵中的植物乳桿菌在pH 值3.5 時仍可以增殖并產酸，楊悅、孫盛等人[27-28]報道的植物乳桿菌LV02 和WHH589 的pH 值耐受值也低于3.5。從青貯中分離得到的植物乳桿菌具有更強的適應性，能夠在短時間內度過遲緩期，進入對數期并產酸[26-27]。

2.2 戊糖片球菌的生理特性研究

2.2.1 溫度對戊糖片球菌影響

不同溫度下戊糖片球菌中乳酸質量濃度、pH值、OD 值的變化見圖3。

由圖3（a） 可知，當pH 值為6.5，戊糖片球菌在20 ℃培養時，12 h 后乳酸質量濃度下降，21～33 h乳酸質量濃度基本穩定，產酸速度基本為零，33 h后乳酸質量濃度有所上升。在30，37 ℃培養3 h 后開始產乳酸，3～6 h 產乳酸速度最快，9 h 后乳酸質量濃度下降，12～27 h 乳酸質量濃度開始上升，27～33 h 乳酸質量濃度基本穩定，產酸速度基本為零，33 h 后乳酸質量濃度開始上升，且在37 ℃培養時，乳酸質量濃度1 480 mg/mL，達到最高；在42 ℃培養時，培養3 h 后開始產乳酸，3～6 h 產酸速度最快，之后乳酸質量濃度基本穩定且最大為1 440 mg/mL；在50 ℃培養時，檢測到的乳酸水平一直很低，可以基本判定戊糖片球菌在50 ℃不生長。由圖3（b） 可知，在20，30，37 ℃時，菌液的pH 值維持穩定，在50 ℃培養時取得樣液的pH 值基本不變，戊糖片球菌在50 ℃不產生乳酸。且由圖3 可知，pH 值變化與乳酸質量濃度變化相對應，二者呈負相關。由圖3（c） 可知，在20，30，42 ℃時，菌體密度變化情況基本相同，在培養一開始并沒有出現明顯改變，3 h后乳酸菌進入對數生長期，6 h 后逐漸生長遲緩，到達穩定期，在20，42 ℃時，乳酸菌還會增加直到36 h 菌體密度保持穩定不變；在37 ℃時，可以看出3～21 h 時乳酸菌的對數生長期，穩定期為21～48 h；在50 ℃時OD 值基本保持穩定不變，說明并無乳酸菌生長。

圖3 不同溫度下戊糖片球菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化

綜上所述，當溫度高于50 ℃時該戊糖片球菌無擴增、產酸等生理現象，生命代謝基本停止。當溫度處于20～42 ℃時，該戊糖片球菌能夠增殖、產酸。且均從接種3 h 后開始快速產酸，其中溫度在30，37，42 ℃時其產酸效果相近，20 ℃下的產酸效果明顯較弱。其主要原因在接種3 h 后20，30，37，42 ℃發酵條件下的戊糖片球菌均進入對數生長期，受溫度的影響，20 ℃條件下戊糖片球菌在達到穩定期后菌液質量濃度明顯低于其他溫度。

2.2.2 pH 值對戊糖片球菌影響

不同pH 值下戊糖片球菌中乳酸質量濃度、pH值、OD 值的變化見圖4。

圖4 不同pH 值下戊糖片球菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化

由圖4（a） 可知，戊糖片球菌在pH 值為4.5，7.5，8.5 的條件下培養時主產酸期為12～21 h，而21～24 h 時產酸速度遲緩，24 h 后乳酸質量濃度基本達到穩定；在pH 值為5.5，6.5 的條件下培養時，3 h 后開始產酸，之后產酸速度緩慢增加，在pH 值為6.5 培養時終產酸質量濃度最大，為1 480 mg/mL；在pH 值為3.5 培養時，檢測到的乳酸水平一直很低，可以判定戊糖片球菌在pH 值為3.5 時不生長，33 h 后乳酸濃度有所上升。由圖4（b） 可知，在0～9 h 期間，初始pH 值為6.5 培養時pH 值下降最快，pH 值為5.5 時次之；初始pH 值為7.5，8.5 培養時，在12～21 h 期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為4.5 培養時，在12～24 h期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為3.5 培養時，pH 值基本保持不變。由圖4（c）可知，初始pH 值為5.5 培養時，3 h 后細菌迅速繁殖，進入對數期，穩定期為33 h 后；初始pH 值為6.5 培養時，6 h 后細菌進入對數期，21 h 后到達穩定期；初始pH 值為4.5 培養時，12 h 后細菌開始迅速繁殖，進入對數生長期，27 h 后生長逐漸遲緩，達到穩定期；初始pH 值為7.5，8.5 培養時，12 h 后細菌開始迅速繁殖，進入對數生長期，21 h 后生長逐漸遲緩，到達生長穩定時期；初始pH 值為3.5 培養時，OD 值一直處于較低的水平，說明基本無乳酸菌生長。

綜上所述，隨著發酵時間的不斷延長，整個發酵體系的pH 值不斷降低，最終穩定在pH 值3.5 左右。當發酵體系的pH 值達到穩定值3.5 后，pH 值不再大幅度變化，即戊糖片球菌在pH 值低于3.5 的條件下代謝受到抑制、無乳酸產生、菌體無擴增，菌體在該pH 值條件下無生命特征。菌體的擴增、產酸基本是同時進行的，該戊糖片球菌的最適pH 值為6.5，在該pH 值條件下菌體產酸速度最快，最終乳酸濃度最高，菌體密度最大。與裴慧潔[29]研究結果相似，戊糖片球菌Z-1 在pH 值2～10 時具有良好的酸堿穩定性。試驗結果與已有報道結果基本一致，而對于不同種類的戊糖片球菌，產酸存在差異性，潘佳雯[30]研究發現當pH 值為3.5 時，戊糖片球菌XY46可繼續增殖。

2.3 類干酪乳桿菌的生理特性研究

2.3.1 溫度對類干酪乳桿菌影響

不同溫度下類干酪乳桿菌中乳酸質量濃度、pH值、OD 值的變化見圖5。

由圖5（a） 可知，類干酪乳桿菌在20 ℃培養時，3 h 后開始產乳酸，3～6 h 間產酸速度最快，12 h后乳酸濃度出現明顯下降，21～33 h 乳酸質量濃度基本穩定，產酸速度基本為零，33 h 后乳酸質量濃度有所上升；在30，37 ℃培養時接種3 h 后開始產乳酸，3～6 h 產乳酸速度最快，此后在37 ℃時30 h 后乳酸質量濃度基本穩定，產酸量最多，為1 920 mg/mL；而在30 ℃培養時，21～33 h 乳酸質量濃度基本穩定，33 h 后乳酸質量濃度又開始上升，36 h 乳酸質量濃度基本穩定；在42 ℃培養時，接種3 h 后開始產乳酸，3～9 h 產乳酸速度最快，之后乳酸質量濃度一直呈緩慢上升狀態；在50 ℃時培養時，檢測到的乳酸水平一直很低，可以基本判定類干酪乳桿菌在50 ℃不生長。由圖5（b） 可知，在20，30，37 ℃時，菌液的pH 值變化維持基本穩定狀態，在50 ℃培養時樣液的pH 值基本保持不變。且由圖5 可知，pH 值變化與乳酸質量濃度變化相對應，二者呈負相關。由圖5（c） 可知，在20～42 ℃時，菌體密度變化情況基本相同，在培養開始并沒有出現顯著改變，6 h之后細菌生長迅速，進入對數生長期，對數期過后逐漸趨于平緩，到達生長穩定時期；在50 ℃時OD值基本保持穩定不變，說明并無乳酸菌生長。

圖5 不同溫度下類干酪乳桿菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化

綜上所述，當溫度高于50 ℃時該類干酪乳桿菌無擴增、產酸等生理現象，生命代謝基本停止。當溫度處于20～42 ℃時，該類干酪乳桿菌能夠增殖、產酸。且均從接種3 h 后開始快速產酸，其中溫度在37 ℃時產酸效果最佳，20 ℃下的產酸效果明顯較弱。結論與李彬等人[31]研究的與副干酪乳桿菌（Lactobaci llusparacasei JCM1171） 的相似性為99.83%的CSND-6 菌株在30～44 ℃的溫度范圍生長基本一致。

2.3.2 pH 值對類干酪乳桿菌影響

不同pH 值下類干酪乳桿菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化見圖6。

圖6 不同pH 值下類干酪乳桿菌中乳酸質量濃度、pH 值、OD 值的變化

由圖6（a） 可知，類干酪乳桿菌在pH 值為7.5，8.5 條件下培養時主產酸期為12～21 h，而21～33 h 期間產酸速度減緩，33 h 后乳酸質量濃度基本保持不變；在pH 值4.5 培養時，主產酸期為12～21 h，而21～48 h 期間產酸速度減緩，乳酸質量濃度不斷增大；在pH 值為5.5，6.5 條件下培養時，3 h 時開始產酸，之后乳酸質量濃度下降，后來產酸速度緩慢增加，33 h 后乳酸質量濃度基本保持不變，在pH 值6.5 培養時終產酸質量濃度最大為1 920 mg/mL；在pH 值為3.5 培養時，檢測到的乳酸質量濃度一直很低，可以判定類干酪乳桿菌在pH 值為3.5 時不產生乳酸。由圖6（b） 可知，在0～9 h 期間，初始pH值為6.5 培養時pH 值下降最快，接下來為pH 值5.5培養；初始pH 值為7.5，8.5 培養時，在12～21 h 期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為4.5 培養時，在12～24 h 期間pH 值下降最快，24 h 后pH 值基本保持不變；初始pH 值為3.5培養時，pH 值基本保持不變。由圖6（c） 可知，初始pH 值為5.5，6.5 條件下培養時，3 h 后進入對數期，30 h 后到達生長穩定時期；初始pH 值為8.5 培養時，12 h 后進入對數期，21 h 后達生長穩定期；初始pH 值為4.5 培養時，12 h 后細菌迅速繁殖，進入對數生長期，30 h 到達生長穩定時期，終了菌體密度達到最大；初始pH 值為7.5 培養時，12 h 后細菌進入對數期，24 h 后細菌生長遲緩，36 h 到達穩定期；初始pH 值為3.5 培養時，30 h 后OD 值一直在緩慢增大，但一直處于較低的水平，說明基本無乳酸菌生長。

綜上所述，隨著發酵時間的不斷延長，整個發酵體系的pH 值不斷降低，最終穩定在pH 值3.5 左右。當發酵體系的pH 值達到穩定值3.5 后，pH 值不再大幅度的變化，即類干酪乳桿菌在pH 值低于3.5 的條件下代謝受到抑制、無乳酸產生、菌體無擴增，菌體在該pH 值條件下無生命特征。菌體的擴增、產酸基本是同時進行的，該類干酪乳桿菌的最適pH 值為6.5，在此pH 值條件下菌體產酸速度最快，pH 值下降最快，最終菌體密度最大。該結論與李彬等人[31]研究的CSND-6 菌株在pH 值為6～8 時生長較快的結論基本一致。

3 結論

（1） 對于植物乳桿菌，適合菌株生長的溫度有20，30，37 ℃，適合產乳酸的溫度為42 ℃。當pH值為6.5，溫度為30 ℃（前期），42 ℃（后期） 梯度培養時，生長速度較快、菌體密度最大、最終乳酸質量濃度最高，可達到快速發酵的目的。

（2） 對于戊糖片球菌，適合菌株生長的溫度有20，30，37 ℃，適合產乳酸的溫度為37，42 ℃；當pH 值為6.5，溫度為37 ℃培養時，生長速度較快，最終乳酸質量濃度最高。

（3） 對于類干酪乳桿菌，適合菌株生長的溫度有20，30，37 ℃，適合產乳酸的溫度為30，37 ℃；當pH 值為6.5，溫度為37 ℃培養時，生長速度較快，菌體密度較大，最終乳酸質量濃度最高。

（4） 微生物的生長受到環境pH 值與溫度的影響，在不同pH 值與溫度下，影響程度差異較大。實驗中的3 株乳酸菌在pH 值低于3.5 的條件下基本不生長；溫度為50 ℃條件下基本不生長。

（5） 研究表明，酸度在一定程度上也能反映菌株的生長性能。菌株產酸量越高，環境的pH 值越低。乳酸菌在生長時pH 值下降較快的時間段為培養后3～9 h。在隨后的培養時間里3 株乳酸菌的pH 值基本保持不變。