林氏消化液和厚金格爾消化液水解結果與運用比較

詹益雄，徐江峰，李 浪，李方麗，翁雅倩，車 騰，瞿明霞

（武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北武漢 430207）

在菌苗類培養基中，通過胰酶消化牛肉得到的蛋白胨作為氮源被廣泛使用，如用林氏消化液制作白喉桿菌培養基，用厚金格爾消化液制作腦膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌培養基[1]。多年來的培養結果證實胰酶消化牛肉的蛋白胨是質量穩定、高效的基礎營養成分。通過胰酶消化牛肉得到的消化液通過噴霧干燥制得的干粉，也開始在國內運用。各疫苗生產單位在生產牛肉胰酶消化液類產品的工藝上不盡相同，大多在原始制法上做過改良；由于各單位該類產品品種少，并未形成統一標準，通過分析林氏消化液和厚金格爾消化液的制作和水解結果，結合其使用范圍，為該類消化液運用和質量標準建立提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰酶粉（1∶250，BR）；上海瑞永生物科技有限公司提供；20%氫氧化鈉溶液，自備；新鮮黃牛肉，市售。

1.2 檢測用試劑、主要儀器設備

1.2.1 檢測用試劑

磷酸鹽標準緩沖液（pH 值6.86）、硼砂標準緩沖液（pH 值9.18）、0.85%生理氯化鈉溶液、2%硼酸溶液、30%氫氧化鈉溶液、消化劑、0.1 mol/L 硫酸溶液和1 mol/L 氫氧化鈉溶液、0.05 mol/L 鹽酸溶液、溴百里香酚藍指示劑、0.5%酚酞指示劑、硼酸鹽緩沖鹽水。

1.2.2 儀器設備

電子天平、pH 計（賽多利斯pb-10）、Buchi 自動凱氏儀（K-370，系列號1000073773）、恒溫水浴箱等。

1.3 試驗方法

1.3.1 林氏消化液制備

新鮮黃牛肉經過除脂、除筋膜、清洗、攪碎處理后，將20 000 g 新鮮碎黃牛肉加注射用水定容至60 L，加溫至90～100 ℃后，降溫至50～55 ℃，并維持恒溫50～55 ℃，不斷攪拌，消化過程中用20%氫氧化鈉溶液調整pH 值并維持pH 值7.8～8.0。計時，胰酶粉分4 次加入，前3 次加入2/7，后1 次加入1/7，每隔30 min 加胰酶粉1 次，共加胰酶粉480 g。水解2.5 h 后，加入冰醋酸1 500 mL，煮沸后澄清過濾，取樣，滅菌，檢測AN 值、TN 值。

1.3.2 厚金格爾消化液制備

新鮮黃牛肉經過除脂、除筋膜、清洗、攪碎處理后，將20 000 g 新鮮碎黃牛肉加水定容至70 L，煮沸30 min，冷卻至50～55 ℃，并維持恒溫50～55 ℃攪拌，消化過程中用20%氫氧化鈉溶液調整pH 值并維持pH 值7.8～8.0，胰酶粉分2 次加入，每次加入胰酶粉160 g，每隔30 min 加胰酶粉1 次，共加胰酶粉320 g。在加入20%氫氧化鈉溶液調整pH 值，且2 次測量（測量間隔≥15 min），在pH 值7.8～8.0 時，轉移至38 ℃密閉抑菌條件下，水解240 h，每12 h攪拌1 次，水解完成后取出煮沸，澄清過濾，取樣，滅菌，檢測AN 值、TN 值。

1.3.3 水解度計算和分析

用滴定法（加中性甲醛，與α - 氨基作用后，再以氫氧化鈉溶液滴定羧基） 確定樣品氨基氮含量。用Buchi 自動凱氏儀（半微量法） 測定樣品總氮。水解度值按照AN/TN 計算。

2 結果與分析

2.1 AN 值和TN 值檢測結果

林氏消化液共得到24 批次檢測數據，厚金格爾消化液共得到24 批次檢測數據。

AN 值和TN 值檢測結果見表1。

表1 AN 值和TN 值檢測結果

2.2 AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值計算

分別計算林氏消化液和厚金格爾消化液的AN 平均值和TN 平均值，兩者比值為AN/TN 值。2 種消化液AN/TN 值極顯著差異性（p＜0.01）。

AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值見表2。

表2 AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值

2.3 林氏消化液和厚金格爾消化液運用比較

統計2 種消化液，林氏消化液使用范圍較窄，主要用于白喉桿菌、肉毒桿菌、水腫梭菌、溶組織梭菌的培養基氮源；厚金格爾消化液使用范圍較廣，主要用于金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟氏菌、白色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、副傷寒甲沙門氏菌、副傷寒乙沙門氏菌、百日咳桿菌、霍亂、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、土拉倫菌、甲型溶血性鏈球菌的培養基氮源。比較AN/TN 值，得出更高水解度的消化液適用范圍更廣。

3 結論

對林氏消化液和厚金格爾消化液的水解液AN 值和TN 值進行檢測，通過AN 值和TN 值平均值計算的AN/TN 值得出，厚金格爾消化液AN/TN 值比林氏消化液AN/TN 值高14.54%。比較林氏消化液和厚金格爾消化液工藝，溫度是變量，溫度升高加速水解反應過程[2]；厚金格爾消化液制作后期是密閉抑菌消化，通過檢測發現隨著消化時間延長其pH 值為7.0～7.8 呈緩慢下降趨勢，不在胰酶最佳消化pH 值范圍內[3-4]，也為水解不利因素，不計上述2 項不利因素作用，消化時間對水解的正向作用仍明顯。厚金格爾消化液前期50～55 ℃消化階段平均為1.5 h，在進入后期消化前，未進行AN 值和TN 值檢測，以及后期240 h 的消化分子量變化趨勢未進行檢測，該部分趨勢尚需再通過試驗進行研究。

林氏消化液主要用于白喉桿菌、魏氏梭菌、氣性壞疽、肉毒梭菌等的培養基制作，厚金格爾消化液主要用于霍亂弧菌、鼠疫桿菌、布魯氏桿菌、炭疽熱桿菌、土拉桿菌、志賀菌、百日咳、甲型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏菌、傷寒桿菌等的培養基制作[1]。大多數革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對于基礎液的水解度要求更低，即革蘭氏陰性菌深層培養的基礎液水解度更低。革蘭氏陽性菌深層培養大多選用類似于林氏消化液的基礎營養液，如破傷風梭菌的深層培養選用的基礎液是牛肉胃酶消化液，在現階段常見基礎液中水解程度幾乎為最低；革蘭氏陰性菌的深層培養大多選用類似于厚金格爾消化液，或者相似水解程度的干酪素水解液[5-6]，有些甚至直接用全綜合培養基培養，如無細胞百日咳疫苗生產時所用的SSM培養基或者其改良培養基[7-11]。這些事例反映細菌營養條件在不同胨或者氮源的分子量方面是不同的；在氮源替換試驗上或者培養基改良上，應重視氮源成分的分子量分布。另外，現階段各疫苗生產廠家對培養基的改良試驗頻繁且迅速，僅僅追求深層培養菌體數量的增多尚不能體現培養基改良試驗的成功，抗原性的保持也是培養基改良試驗面臨的新課題[12]。