肉及肉制品微生物檢測新技術研究進展

胡三梅

（北京電子科技職業學院后勤基建處，北京 100076）

肉及肉制品富含蛋白質、脂類、維生素以及鐵、鋅等礦物質，是優質動物蛋白的重要來源，同時我國肉及肉制品產量巨大，近10 年肉類平均年產量近8 505 萬t， 其中肉制品產量占15%～20%，其食用安全性備受人們關注。2021年國家市場監督管理總局及各省、直轄市、自治區公布的本年度監督抽檢情況顯示，肉及肉制品共1 264 批次不合格，不合格項目類別主要涉及獸藥、微生物、添加劑、質量指標、污染物、標簽、非法添加等，其中微生物不合格數量達到346 批次，占不合格總數的27.4%（注：因國家市場監督管理總局及各地市場監督管理局抽檢公告較多，此處僅列出國家市場監督管理總局2021年最后一項抽檢公告）。本文介紹肉及肉制品中微生物限量要求，分析傳統微生物檢測方法的弊端，綜述快速測試片法、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物熒光法、分子診斷法、免疫分析法、光譜法及儀器法等新技術在肉及肉制品微生物檢測應用中的研究進展。

1 我國肉及肉制品相關標準中微生物限量要求

肉及肉制品的營養成分適宜微生物的生長繁殖，微生物數量也是肉及肉制品相關標準中的重要衛生指標和安全指標，相關標準中對微生物的限量要求如表1～2所示。

表 1 肉類（原料肉）相關標準中的微生物限量要求Table 1 Microbial limit requirements specified in meat standards

表 2 肉制品相關標準中的微生物采樣方案及限量要求Table 2 Microbial sampling scheme and limit requirements specified in processed meat standards

由表1～2可知，對肉及肉制品有限量要求的微生物種類包括菌落總數、大腸菌群、沙門氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157:H7）、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和單核細胞增生李斯特氏菌，其中菌落總數和大腸菌群代表產品的衛生情況，在鮮牛肉、肉松、肉脯、火腿腸、熏煮火腿、熏煮香腸等產品標準中為出廠檢驗指標，每批次均需檢驗合格后方能出廠。

2 傳統微生物檢測方法

傳統微生物檢測采用食品安全國家標準食品微生物檢驗4789系列標準，如GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》、GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.6—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》、GB 4789.36—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》、GB 4789.5—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗》、GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.11—2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 β型溶血性鏈球菌檢驗》及GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》。通常需提前配制稀釋管、培養基，對使用的稀釋管、培養基和相關耗材進行高壓滅菌，經樣品處理、稀釋、加樣、培養、計數等環節才能得到檢測結果，通常需2 d以上，操作費時費力。為能得到準確結果的同時縮短檢測時間、降低檢測成本，研究人員開發了新型的微生物檢測技術。

3 肉及肉制品微生物檢測新技術

3.1 快速測試片法

快速測試片法是將培養基系統預先制備在測試片上，微生物菌落在測試片上呈紅色或粉紅色，可增強微生物計數效果。趙立冬等分別使用快速測試片法與 GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》檢測熟肉樣品、人工污染熟肉樣品的菌落總數結果一致性，發現2 種方法檢測結果相關系數分別為0.897、0.964，檢測結果一致性較好。快速測試片法與傳統的平板計數法原理相同，但該方法無需提前配制培養基、稀釋液，檢測步驟較少、效率高，培養時間僅需24 h，可大幅節省檢測時間，同時可節省菌落總數檢測過程中的時間和人力成本，目前已形成成熟的商業化產品。

3.2 ATP生物熒光法

ATP廣泛存在于生物活體內，且每個微生物活菌細胞中均有含量近似的ATP，熒光素酶是一種生物活性催化劑，可將ATP的化學能轉化為光能。ATP在具備熒光素酶、氧氣、鎂離子的環境中可與熒光素反應產生熒光，熒光強度與ATP含量呈線性關系，通過檢測生物熒光即可間接獲得菌落總數。黃彬等優化肉及肉制品中微生物ATP提取方法，分別采用十六烷基三甲基溴化銨和-環糊精為微生物細胞ATP的提取劑和中和劑，發現當肉制品中微生物濃度為10～10CFU/mL時測得的發光強度對數值與平板計數結果對數值相關系數為0.929 1，可用于實際檢測，但因無法排除體細胞ATP的影響而不適用于原料肉的菌落總數檢測。

3.3 分子診斷法

3.3.1 多重實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法

多重實時PCR是在常規PCR的基礎上加入多對特異性引物，通過DNA聚合酶催化及堿基配對實現對引物界定的DNA樣品中不同序列擴增，具有檢測通量高、靈敏度高、成本低等優勢，近年來發展迅速。Elisa等利用多重實時PCR方法同步檢測肉制品中沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7和單核細胞增生李斯特氏菌，若樣品中只含有這3 種致病菌中的一種，則檢測限可達10 CFU/g， 若樣品中有3 種致病菌，則檢測限為10CFU/g。范維等使用多重實時PCR的方法同步檢測散裝即食肉制品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌，增菌5 h后，3 種微生物的檢出限分別達到3.8、4.9、5.7 CFU/mL。 熊蘇玥等利用多重實時PCR方法同步檢測香腸中的金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7及霉菌，5 種致病微生物在20 h內的檢出限均可達100 CFU/25 g。Nguyen等先將雞肉中沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7與單核細胞增生李斯特氏菌增菌12 h，再使用多重實時PCR檢測，與不增菌直接檢測相比可將檢出限降低1 個數量級。閆琳等將人為接種沙門氏菌的禽肉增菌12 h后，再利用多重實時PCR檢測，檢出限可低至100 CFU/25 g。由此可見，多重實時PCR檢測微生物，尤其是致病菌的高靈敏度是建立在增菌培養處理的前提下，增菌時間越長，靈敏度越高，實際檢測過程中需根據樣品情況在檢測時間和檢測限二者間進行平衡。

3.3.2 等溫擴增技術

等溫擴增技術僅需簡單的恒溫儀器既可實現核酸體外擴增，已成為PCR擴增技術的替代性選擇，包括環介導等溫擴增、滾環擴增、單引物擴增等技術。 Ledlod等開發了基于環介導等溫擴增技術和雙向側流試紙相結合的方法，可在45 min內快速檢測肉品中單核細胞增生李斯特氏菌，檢出限達20 CFU/g。Chen Xingxing等開發了基于等溫擴增技術的豬肉制品金黃色葡萄球菌快檢方法，檢出限達50 CFU/mL。等溫擴增技術的缺點在于對引物設計的要求較高，同時易形成氣溶膠，造成假陽性，影響檢測結果。

3.4 免疫分析法

3.4.1 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是一種以膠體金作為標記物應用于檢測特定抗原或抗體的一種新型免疫標記技術。膠體金在弱堿性環境下帶負電荷，可與帶正電荷基團的蛋白質分子、伴刀豆球蛋白A、植物血漿凝集素、萄球菌A蛋白等生物大分子結合，在顯微鏡下呈黑褐色，若有大量結合物聚集則用肉眼即可觀察到粉紅斑點，可用于定性或半定量的快速免疫檢測。劉志科等開發出雞白痢沙門氏菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條，與其他病原菌無交叉反應，檢測結果與平板凝集實驗符合率達到96.4%。Song Chunmei等成功研制出一種膠體金免疫層析試紙條，用于快速檢測肉凍等食品中志賀氏菌和大腸桿菌O157:H7。膠體金免疫層析技術的缺點在于無法實現高通量檢測，且其準確性高度依賴抗體的特異性。

3.4.2 熒光量子免疫試紙條法

熒光量子表面具有不同的官能團，通過修飾即可與抗體等生物大分子偶聯，同時熒光量子點具有穩定性好、熒光強度高等特點，可提高免疫層析試紙條的靈敏度和穩定性。朱芳茜等利用自制的量子點偶聯志賀氏菌單克隆抗體，研制了一種可視化檢測志賀氏菌的量子點免疫熒光試紙條，該試紙條在豬肉、火腿腸等樣品中的檢測限為1×10CFU/mL，單樣品檢測時間為15 min。熒光量子免疫試紙條法的缺點在于檢測限較高，目前仍無法滿足肉制品中致病菌的檢測限量要求。

3.5 光譜檢測

3.5.1 近紅外光譜法

近紅外光譜波長為780～2 526 nm，是介于可見光與中紅外光之間的電磁波，可反映分子化學鍵基頻振動的倍頻和合頻吸收，結合化學計量學方法（如偏最小二乘法）可實現快速、無損、多組分同步檢測含氫官能團的有機物，已廣泛應用于豬胴體、鮮豬肉、鮮牛肉及凍牛肉、鮮羊肉、鮮雞肉、羊肉卷、牛肉漢堡餅等肉及肉制品的檢測。Alexandrakis等利用近紅外光譜法可定性識別雞胸肉中是否含李斯特菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌和大腸桿菌。Argyri、Panagou等采用傅里葉變換紅外光譜建立了冷卻牛肉腐敗程度預測模型，新鮮、半新鮮、腐敗冷卻牛肉識別準確率分別達到91.7%、81.2%和94.1%，并可直接預測菌落總數。Grau等開發了基于短波近紅外光譜技術的包裝切片雞胸肉新鮮度快速定性檢測技術，可與腐敗特征指標菌落總數的指示作用保持一致。

3.5.2 表面增強拉曼光譜法

光束照射到物體表面時出現的少部分折射光方向和波長均發生變化的散射為拉曼光譜。不同的被照射物質分子中的官能團各不相同，由此產生振動的拉曼光譜可提供分子結構信息，從而實現對被照射物質的快速檢測。但是拉曼光譜易受干擾，導致信號較弱，通過貴金屬表面糙化處理可使拉曼信號增強，這種現象被稱為表面增強拉曼，可實現痕量物質的快速檢測。Ma Xiaoyuan等在多刺納米金粒子上修飾巰基化適配體作為表面增強拉曼納米探針，檢測豬肉樣品中的沙門氏菌，檢測限為4 CFU/mL，加標回收率為96.55%～105.45%。Zhang Hui等利用適配體固定化磁性納米金粒子捕獲豬肉樣品中的金黃色葡萄球菌，經優化后表面增強拉曼法檢出限為35 CFU/mL，加標回收率為94.12%～102.75%。拉曼光譜也可反映肉中蛋白質結構變化，從而反映肉的腐敗變質程度。

3.5.3 高光譜成像技術

高光譜成像技術是一種光譜和圖像融合的光電檢測技術，能同時反映樣品內外部的信息，光譜波段覆蓋了紫外、近紅外、可見光區域，分辨率可達納米級別，是一種融合光學、計算機、信號處理學的檢測技術。Peng Yankun等開發基于高光譜成像系統的豬肉菌落總數檢測技術，使用逐步判別法篩選出可表征菌落總數的5 個最佳波長，通過最小二乘支持向量機建立了理想的預測模型。郭中華等開發了可檢測羊肉表面菌落總數的高光譜成像系統，經優化的人工神經網絡模型相關系數可達0.998 8。趙俊華等利用高光譜成像技術開發臘肉菌落總數的定量分析技術，校正集和預測集相關系數分別為0.808和0.798。李文采等以市售冷藏雞胸肉為研究對象，建立基于高光譜成像技術的菌落總數快速預測模型，校正集和驗證集相關系數分別為0.93和0.86。 王偉等以生鮮豬肉為研究對象，選用最小二乘支持向量機的建模方法構建基于高光譜成像技術的細菌總數預測模型，與標準平板菌落總數記數法所檢測的細菌總數相關系數達到0.94以上。

光譜法對肉及肉制品中有機物含量有較好的預測效果，同時具有一定的定性判別能力，但目前光譜類設備價格較高，未開發出針對不同產品基質的微生物檢測專用設備，且多為預測方法，仍需對其預測準確性進行大量驗證才可進行實際應用。

3.6 儀器法

3.6.1 流式細胞術

流式細胞術是融合流體力學、激光學、熒光染色科學和計算機科學的細胞分析技術，具有快速、多指標、分析全面等特點。隨著流式細胞術在各領域中的應用越來越多，商品化的流式細胞儀也越來越成熟。微生物通常由分析型的流式細胞儀檢測，該設備包括液流系統、光路檢測系統和檢測分析系統，將待測樣品制成單細胞懸液，經液流系統進入光路檢測系統，細胞在激光照射下發生散射和折射，產生的散射光信號和熒光信號由不同的通道接收，經計算機分析處理得出檢測結果。 黃韻分別采用Guava EasyCyte 6-2 L流式細胞儀和平板計數法對冷鮮肉中的單增李斯特菌進行檢測，研究發現，單增李斯特菌在4 ℃冷鮮肉中經過16 d培養后流式細胞儀和平板計數法檢測結果分別為5.4×10、5.3×10CFU/g， 二者結果十分接近。流式細胞術的缺點在于只能對細胞等生物分子進行分析檢測，肉及肉制品等食品中不同基質需使用不同的熒光染料標記，存在熒光信號重疊的可能性，會降低檢測準確性。

3.6.2 電化學法

微生物在培養過程中，生理代謝作用使培養基的電惰性物質（如碳水化合物、類脂、蛋白質）轉化為電活性物質，大分子物質轉化成小分子物質，體系的阻抗降低，因此可以通過測定體系中電流或電位的變化規律，構建電流或電位與微生物濃度的關系模型，進而測定出體系中微生物的濃度。這種方法具有測定快速、直觀、操作簡單、測定設備成本低和信號可控等特點。 劉飛等依據微生物呼吸作用的電子傳遞規律，采用原電池的工作原理，開發基于電化學法的冷鮮肉中菌落總數快速預測技術，預測值和實測值的差異（預測值和實測值差值的絕對值與其平均值的比率）在15%以內。

4 結 語

食品安全法規定，食品應檢驗合格后方可出廠或銷售，而傳統微生物檢測方法檢驗周期較長，菌落總數和大腸菌群2～3 d、食源性致病菌3～5 d，對鮮牛肉、熏煮香腸等保質期較短且出廠必須檢測微生物的肉及肉制品造成了極大的流通壓力和經濟損失，因此微生物檢測新技術和儀器在肉類領域具有巨大的市場需求。本文綜述6 種類型、11 種肉及肉制品微生物檢測新技術的研究進展，多數具備節省檢測時間的優勢，滿足了肉類企業縮短檢測周期的需求，但多數檢測方法仍停留在實驗室研究階段，存在實際檢測應用對比數據偏少、儀器商品化程度低等問題，建議加強檢測新技術與傳統檢測方法在實際樣品檢測應用中的比對工作，改進檢測方法細節，進一步提高檢測準確率，同時推動新技術的標準化，加快新技術與設備在實際檢測中的應用。