微波輔助酸水解褐藻糖膠的研究

馮金華 劉紅英 姜帥 鄭文靜

摘要 [目的]研究微波輔助酸解在低分子量海帶褐藻糖膠制備中的可行性。[方法]采用酸提取法制備海帶褐藻糖膠，測定在不同HCl濃度（0、1、2 mol/L）、不同降解時間（40、50、60 min）、不同降解溫度（70、80、90 ℃）條件下微波輔助酸解得到的褐藻糖膠的分子量，分析不同降解條件對褐藻糖膠分子量的影響，并與水浴輔助酸解的結果進行對比分析。[結果]隨著HCl濃度、降解時間、降解溫度的升高，酸解產(chǎn)物的分子量降低，且溫度對降解產(chǎn)物分子量的影響最大。與水浴加熱相比，微波輔助酸解降解產(chǎn)物的分子量更低。在80 ℃，HCl濃度為1 mol/L，降解40 min以上，比較容易制備低分子量褐藻糖膠。微波比水浴加熱更容易對褐藻糖膠的硫酸基造成破壞。在2 mol/L HCl條件下，微波和水浴輔助酸解60 min，分別在70和90 ℃觀察到明顯的硫酸基脫除現(xiàn)象。[結論]采用微波輔助酸解法制備低分子量褐藻糖膠時，要注意硫酸基脫除的問題。

關鍵詞 褐藻糖膠;酸解;微波輔助;分子量

中圖分類號 TQ461? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）11-0154-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.040

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Microwave-Assisted Acid Hydrolysis of Fucoidan

FENG Jin-hua1， LIU Hong-ying1， JIANG Shuai2 et al

（1. Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao，Hebei 066003;2. College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract [Objective] To study the feasibility of microwave-assisted acidolysis in the preparation of low molecular weight kelp fucoidan. [Method]Kelp fucoidan was prepared by acid extraction. The molecular weight of fucoidan obtained by microwave-assisted acidolysis under different HCl concentration （0， 1， 2 mol/L）， different degradation time （40， 50， 60 min） and different degradation temperature （70， 80， 90 ℃）， was measured. The effects of different degradation conditions on the molecular weight of fucoidan were analyzed and compared with the results of water bath assisted acidolysis. [Result]With the increase of HCl concentration， degradation time and degradation temperature， the molecular weight of acid hydrolysis products decreased， and the temperature had the greatest influence on the molecular weight of degradation products.Compared with water bath heating， the molecular weight of microwave-assisted acid hydrolysis degradation products was lower. It was easy to prepare low molecular weight fucoidan at 80 ℃， HCl concentration of 1 mol/L and degradation for more than 40 min. Microwave was easier to destroy the sulfate group of fucoidan than water bath heating. Under the condition of 2 mol/L HCl， microwave and water bath assisted acidolysis for 60 min， obvious sulfate removal was observed at 70 ℃and 90 ℃ respectively. [Conclusion]When preparing low molecular weight fucoidan by microwave-assisted acidolysis， attention should be paid to the removal of sulfate group.

Key words Fucoidan;Acidolysis;Microwave-assisted;Molecular weight

褐藻糖膠是來自海洋褐藻的一種含硫酸酯的水溶性多糖，單糖組成主要為巖藻糖，所以又被稱為巖藻聚糖硫酸酯[1]。除褐藻外，巖藻聚糖硫酸酯在無脊椎動物如海參中也存在[2-3]。褐藻糖膠已被證實是一種具有多種功能的多糖，如具有明顯的抗氧化[1，4]、抗凝血[5]、免疫調節(jié)[6]、抗腫瘤[7-8]、抗病毒[9]、抗輻射[10]等功能。褐藻糖膠在日本、美國作為預防和治療癌癥及血栓疾病的藥物已進入市場。在中國，研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠治療腎衰有一定作用，開發(fā)出海昆腎喜膠囊，已獲得新藥證書。褐藻糖膠對于單純孢疹病毒、艾滋病病毒、煙草花葉病毒等病毒均有一定的抑制作用，加上褐藻糖膠具有明顯的抗氧化活性及免疫調節(jié)活性，在治療新冠肺炎感染上也可能具有一定的應用潛力。所以褐藻糖膠的研究有較大的應用前景和市場潛力。

褐藻糖膠的功效與其獨特的多糖結構和相對分子質量有一定的關系。有研究認為，褐藻糖膠的分子量大小可以影響多糖的吸收效果，且吸收效率大致與分子量成反比[9]，低分子量褐藻糖膠在很多情況下表現(xiàn)出比大分子量較好的生物活性[11-12]，且低分子量褐藻糖膠具有黏度低、易吸收、生物利用率好等優(yōu)點。所以低分子量褐藻糖膠也是目前的一個研究熱點。

現(xiàn)在應用于制備低分子量褐藻糖膠的方法主要有酶降解法[13]、酸降解法[14]、H2O2降解法[15]和超聲波降解法[16]等。物理方法輔助降解多糖已有很多報道，常用的為紫外線、γ射線、微波輻射等。與傳統(tǒng)加熱相比，發(fā)現(xiàn)微波輻射可以提高降解速率，改善反應條件，大大減少了反應時間，有利于節(jié)約能源。采用微波輔助降解褐藻糖膠，目前研究還比較少。筆者就微波輔助褐藻糖膠酸降解進行研究，通過比較在不同降解條件下微波輔助和水浴輔助鹽酸降解褐藻糖膠所得降解產(chǎn)物的分子量和結構，探討微波輔助酸降解在低分子量褐藻糖膠制備中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原材料。干海帶，購買于河北省黃驊市市場。

1.1.2 主要儀器。FM100型高速萬能粉碎機，由天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);HH-8型恒溫水浴鍋，由江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);H185OR型臺式高速冷凍離心機，由湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn);D2F-6050AB型電熱真空干燥箱，由天津工興實驗室儀器有限公司生產(chǎn);WGH-30A型雙光束紅外分光光度計，由天津港東科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn);MDS-8G型微波消解儀，由上海新儀微波化學科技有限公司生產(chǎn);78HW-1型恒溫磁力攪拌器，由江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);FA2104N型精密分析電子天平，由上海菁海儀器有限公司生產(chǎn);Scout SE型電子天平，由梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司生產(chǎn);DF-4型壓片機，由天津港東科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn);Agilent 1260型高效液相色譜儀，由美國安捷倫公司生產(chǎn);示差檢測器，由美國安捷倫公司生產(chǎn);TSK G4000-PWXL和 TSK G3000-PWXL凝膠色譜柱，由日本TOSOH公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑。葡聚糖標準品，分子量 410 000、270 000、25 000、12 000、5 000和1 000 Da，由美國Sigma公司生產(chǎn);溴化鉀（AR），由天津天光光學儀器有限公司生產(chǎn);鹽酸（AR），由上海環(huán)發(fā)化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 褐藻糖膠的提取與純化。海帶清洗風干后粉碎至粉狀，200 g海帶粉中加入2 L 0.17 mol/L的鹽酸溶液攪拌均勻。在70 ℃水浴鍋中水浴1 h，離心后吸取上清液保留備用，沉淀再次用鹽酸提取，重復3次，合并上清液，用NaOH調pH到中性，加熱蒸發(fā)樣品至1 250 mL，室溫冷卻后加540 mL無水乙醇（使無水乙醇體積分數(shù)為30%），保鮮膜封口靜置過夜，離心去沉淀，繼續(xù)加無水乙醇，使無水乙醇體積分數(shù)達到60%，離心取沉淀，干燥得褐藻糖膠粗品，干燥器中保存，備用。重復此酸提取過程，大量制備褐藻糖膠粗品，稱重，貯存?zhèn)溆谩?/p>

將褐藻糖膠粗品溶于蒸餾水中，加入無水乙醇至20%，離心去沉淀（除去溶解的褐藻酸和色素雜質），上清液再加入無水乙醇至其體積分數(shù)為60%，將褐藻糖膠沉淀出來，最后對沉淀物按0.886 g和9 mL水的比例溶解，加乙醇至30%，看是否有沉淀生成，如果離心后有沉淀，繼續(xù)加入無水乙醇至體積分數(shù)為70%，使褐藻糖膠呈半膠體狀態(tài)，按0.1 g NaCl/1 mL水的比例加入氯化鈉使半膠體物質迅速絮凝，離心干燥得到呈褐色的砂狀褐藻糖膠純品。將褐藻糖膠純品用水溶解，透析2 d，然后在透析后的褐藻糖膠溶液中加入無水乙醇使乙醇濃度為80%，密封靜置一夜，離心，收集沉淀，60 ℃烘干，得到焦黃色褐藻糖膠塊狀兒純品，稱其質量，貯存?zhèn)溆肹17]。

1.2.2 褐藻糖膠的降解。采用鹽酸進行褐藻糖膠的降解。配制0.5%褐藻糖膠水溶液，并加入不同體積的濃鹽酸使溶液呈酸性，進行水浴和微波輔助降解。降解條件分別為HCl濃度0、1、2 mol/L，降解時間40、50、60 min，降解溫度70、80、90 ℃。

反應結束冷卻至室溫，將樣品用NaOH中和至pH 7.0，并加入3倍乙醇，醇沉過夜，離心收集沉淀樣品，干燥后稱重，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 褐藻糖膠分子量表征。采用高效凝膠排阻色譜方法對褐藻糖膠原樣及降解后的褐藻糖膠各樣品進行分子量的檢測[18]。

具體分析條件如下：色譜柱為TSK G4000-PWXL和TSK G3000-PWXL;流動相為0.2 mol/L醋酸/0.1 mol/L醋酸鈉溶液;流速1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測器為示差檢測器。樣品濃度為0.4%（ W/V ）。采用不同分子量的葡聚糖（410 000、270 000、25 000、12 000、5 000和1 000 Da）對凝膠色譜柱進行校準。

1.2.4 褐藻糖膠樣品紅外光譜分析（FT-IR）。采用KBr壓片法，在WGH-30A型雙光束紅外分光光度計上對褐藻糖膠原樣及降解后的褐藻糖膠樣品進行分析，波長掃描范圍4 000～400 cm-1，記錄紅外光譜圖并分析。

2 結果與分析

2.1 褐藻糖膠的提取

4 000 g海帶干粉共制備褐藻糖膠粗品78 g，產(chǎn)率為1.95%。粗品進一步經(jīng)乙醇分級純化、透析后，共得到褐藻糖膠純品16 g，純品產(chǎn)率為0.4%。

經(jīng)檢測，褐藻糖膠純品平均相對分子量為2.660×105 Da。張全斌等[1]采用水提法制備的海帶褐藻糖膠的平均分子量為10.890×105 Da。徐祖洪等[19]研究的從海帶中制備褐藻糖膠的方法，得率為0.20%～0.35%，與該試驗的研究結果相近。

2.2 降解時間對褐藻糖膠分子量的影響

從圖1可以看出，在HCl濃度為1 mol/L，降解溫度分別為70、80、90 ℃時，在水浴加熱和微波加熱條件下，褐藻糖膠的分子量隨著降解時間的延長都逐漸降低。但都是在70 ℃時褐藻糖膠的分子量隨降解時間延長降低較明顯，80和90 ℃時分子量的降低速度變慢。可能是由于在70 ℃、降解40 min時，降解后產(chǎn)品的分子量還比較高，微波和水浴加熱條件下分別為144.730、265.990 kD，繼續(xù)降解，分子量還有比較大的下降空間，而80 ℃、1 mol/L HCl降解40 min，分別降至17.289、22.515 kD，分子量較小，繼續(xù)降解比較困難。由圖1可知，微波加熱比水浴加熱對褐藻糖膠酸降解有更強的輔助降解作用;但是無論采用微波還是水浴加熱，當溫度為70 ℃、HCl濃度為1 mol/L、降解40 min時，對褐藻糖膠的降解程度均較小;在HCl濃度1 mol/L時，采用70 ℃、降解60 min以上，80、90 ℃降解40 min以上，都比較容易得到低分子量褐藻糖膠。

微波輔助酸解與水浴輔助酸解相比，在相同的降解條件下，降解后的褐藻糖膠的分子量數(shù)量級相似，不同點主要體現(xiàn)在：①同等條件下，微波輔助比水浴加熱后的褐藻糖膠的分子量更低;②從分子量隨降解時間延長的降低趨勢來看，微波輔助酸解褐藻糖膠分子量變化趨勢比較平緩，水浴加熱的分子量變化趨勢出現(xiàn)突變（如70、90 ℃趨勢線），說明微波輔助加熱比較均勻，水浴加熱可能容易出現(xiàn)加熱不均勻，造成降解效果出現(xiàn)微小偏差。

微波條件下，HCl 濃度為1 mol/L時，70 ℃，降解60 min以上，褐藻糖膠分子量降至20.268 kD;80 ℃，在60 min附近，分子量降至12.933 kD;90 ℃，在50 min左右，分子量降至11.117 kD，時間升至60 min時，分子量降至6.599 kD。

2.3 HCl濃度對褐藻糖膠分子量的影響

降解時間選擇50 min，HCl濃度選擇0、1、2 mol/L，考察褐藻糖膠分子量隨酸度的變化趨勢。從圖2可以看出，在HCl濃度為0時，單純的微波和水浴加熱也會引起褐藻糖膠分子量的降低，降解溫度和降解時間相同時，褐藻糖膠分子量在這2種加熱方式下，降低程度相差不大。但是在2種加熱條件下，70 ℃加熱50 min，分子量與降解前（265.990 kD）相比，基本沒降低;80 ℃加熱50 min，不論是微波加熱還是水浴加熱，分子量降低開始明顯;90 ℃加熱50 min，分子量降低更明顯。所以，在HCl濃度為0時，溫度在80 ℃以上時，加熱本身可以引起褐藻糖膠分子量比較明顯的降低。說明褐藻糖膠水提取時，加熱溫度在低于70 ℃時，對褐藻糖膠分子量的影響較小。

在微波輔助條件下，隨著HCl濃度的增加，褐藻糖膠分子量逐漸降低。HCl濃度從0升至1 mol/L，在70、80、90 ℃ 3個溫度下分子量都迅速降低，分子量分別降低至98.869、16.497、11.117 kD。顯然，80 ℃與70 ℃相比，分子量要低很多;80 ℃與90 ℃相比，差別不是特別明顯。當HCl濃度從1 mol/L升至2 mol/L，70 ℃時，分子量降至16.134 kD，而80、90 ℃時，分子量分別降至8.560、5.836 kD。

從圖2可以看出，在降解溫度、降解時間、HCl濃度相同的條件下，與水浴輔助相比，微波輔助加熱可使褐藻糖膠的分子量降至更低，但二者差距不大。采用微波加熱，隨降解溫度升高，褐藻糖膠分子量逐漸降低，而水浴加熱80 ℃的趨勢線與90 ℃的趨勢線出現(xiàn)交叉，可能是由于水浴不如微波加熱均勻，所以使結果出現(xiàn)了微小偏差。

2.4 降解溫度對褐藻糖膠分子量的影響

從圖3可以看出，不論是微波輔助酸解還是水浴輔助酸解，在不同HCl濃度、降解時間和降解溫度條件下，降解后褐藻糖膠分子量大小順序基本是70 ℃>80 ℃>90 ℃，所以降解溫度比降解時間和HCl濃度對褐藻糖膠分子量的影響可能要更大。

微波輔助加熱時，2 mol/L、60 min條件下，70、80、90 ℃分別將褐藻糖膠從分子量265.990 kD降解至12.678、9.019、5.184 kD。水浴輔助加熱時，2 mol/L、60 min條件下，70、80、90 ℃分別將褐藻糖膠從分子量265.990 kD降解至28.894、11.603、8.269 kD。從圖3可以看出，微波輔助酸解與水浴輔助酸解相比，同等條件下分子量普遍可以降至更低。

2.5 紅外光譜分析

由圖4可知，降解前，褐藻糖膠紅外圖譜有5個特征吸收峰，分別為峰1，3 438 cm-1的多糖的O—H伸縮振動吸收峰;峰2，2 930 cm-1的糖類的C—H伸縮吸收峰，也是巖藻糖中甲基的吸收峰;峰3，1 642 cm-1的多糖類物質常見的微量水分締合羥基造成的吸收峰，也是糖醛酸的特征吸收峰;峰4，1 245 cm-1處的強峰為硫酸根基團的S==O伸縮振動吸收峰，這個峰說明物質中有硫酸基;峰5，1 046 cm-1處的吸收信號為C—O—C環(huán)內醚的C—O伸縮振動，是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰，也是其糖苷鍵C—O—C的非對稱伸縮振動峰。

從圖4可以看出，不論是水浴加熱輔助酸降解還是微波輔助酸降解，與降解前樣品的紅外圖譜相比，各降解樣品紅外圖譜中的峰1、峰2、峰3基本沒有變化，主要變化發(fā)生在峰4和峰5。

水浴加熱時，在HCl濃度為2 mol/L，70、80 ℃降解60 min，降解產(chǎn)物的紅外圖譜（b、c）與降解前樣品的紅外圖譜（a）基本一樣，即在這些條件下降解，樣品結構基本沒有變化;90 ℃降解60 min的樣品的紅外圖譜（d）的變化比較大，峰4變得很小甚至消失，峰4和峰5變成一個寬峰;峰4是硫酸根基團的S==O伸縮振動吸收峰，這個峰的改變說明樣品中硫酸根的變化;硫酸根在此條件下可能發(fā)生了脫除。

類似的變化也同樣出現(xiàn)在微波輔助降解后的褐藻糖膠樣品b、c和d的紅外圖譜中;3個樣品的紅外圖譜中峰4都變得很小甚至消失，與峰5結合成了一個寬峰;說明微波輔助酸解褐藻糖膠使得褐藻糖膠的硫酸基基團發(fā)生了變化，很可能是發(fā)生了硫酸基脫除。

3 討論與結論

酸水解是一種常用的降解多糖的方法。在酸水解法降解多糖時，可以選擇無機酸和有機酸，而且一般選擇輔助加熱手段。輔助加熱的常用方法有水浴加熱和微波加熱。該研究比較了酸解時采用水浴加熱和微波輔助加熱2種方式，在不同時間、溫度和酸度下對褐藻糖膠的降解效果和差異。

該研究表明，在同等條件下，與傳統(tǒng)水浴加熱相比，微波輔助酸解可以使降解產(chǎn)物的分子量降到更低，而且樣品加熱更均勻。在2種加熱條件下，隨著HCl濃度、降解時間、降解溫度的升高，褐藻糖膠分子量都逐漸降低，但是從數(shù)據(jù)可以看出，溫度對褐藻糖膠分子量的影響比時間、酸度的影響要大。70、80、90 ℃，2 mol/L HCl條件下，降解60 min，微波和水浴加熱，褐藻糖膠分別降至12.678、9.019、5.184和28.894、11.603、8.269 kD。

在該研究設定的條件下，最終降解產(chǎn)物的最低分子量與其他研究中報道的差不多。據(jù)報道，采用自由基方法，琥珀酸+H2O2+VC（CHV）體系降解海帶硫酸多糖，分子量分別可以降至10 000～15 000 Da[20]。采用Harber-Weiss 反應體系和Fenton反應體系，分子量分別可達10 000和8 000 Da[12]。用Cu2+-H2O2自由基氧化體系降解褐藻糖膠，9.0%和4.5%H2O2氧化降解粗糖得到的低分子量糖在2 500～6 000 Da[21]。超臨界CO2脫脂后的裙帶菜提取的褐藻糖膠，應用微波輻射在110～200 ℃處理5～120 min，可將褐藻糖膠降解到低分子量范圍（5～30 kD）[22]。

微波比水浴加熱的反應速率快，在很多微波輔助多糖降解中都有報道。李克成[18]研究了微波輔助下H2O2氧化降解殼聚糖，微波下可以在低溫低過氧化氫濃度的條件下降解殼聚糖，并且效率是傳統(tǒng)加熱條件下的5倍。裙帶菜（ Undaria pinnatifida ）孢子葉中天然巖藻聚糖（5 100 kD），用0.01 mol/L HCl在沸水浴酸解5、15 min，巖藻聚糖硫酸酯的分子量分別降至490和260 kD;用0.01 mol/L HCl微波輔助加熱90、120 s，分子量分別降至300和30 kD[23]。

從該研究結果看出，采用微波加熱時，褐藻糖膠在2 mol/L HCl 70 ℃以上溫度，酸解60 min，硫酸基的紅外吸收峰有了明顯的變化，采用水浴加熱時，褐藻糖膠在2 mol/L HCl 70、80 ℃，酸解60 min，硫酸基的紅外吸收峰沒有明顯的變化，90 ℃時硫酸基吸收峰也有了明顯的變化。由此可見，不論是水浴還是微波輔助酸解，都有可能對產(chǎn)物的硫酸基的含量造成影響，都有可能造成硫酸基的脫除。而且微波比水浴輔助酸解更容易對褐藻糖膠的硫酸基造成破壞。微波輻射可以造成一些硫酸多糖硫酸基的脫除，在其他研究中也有相關報道。如微波法提取龍須菜瓊膠時，發(fā)現(xiàn)隨微波功率的增加，瓊膠分子鏈上的硫酸基團脫除[24]。武曉琳等[25]研究海參巖藻聚糖硫酸酯的降解發(fā)現(xiàn)，酸降解法可以通過調節(jié)反應溫度和酸濃度來控制反應速度，但重現(xiàn)性不好，并且存在著硫酸根脫落現(xiàn)象;酶解法反應條件溫和，重現(xiàn)性好，不存在硫酸根脫落現(xiàn)象。Yang等[23]研究還發(fā)現(xiàn)，裙帶菜孢子葉中天然巖藻聚糖（5 100 kD）用0.01 mol/L HCl在沸水浴酸解5 min制備的巖藻多糖聚合物（490 kD，1 mg/mL）能顯著提高抗癌活性到75.9%;用0.01 mol/L HCl微波輔助加熱90 s的產(chǎn)物對癌細胞的抑制作用甚至低于30%;推測可能是由于經(jīng)苛刻的微波處理后巖藻多糖上硫酸鹽的部分去除的原因。

所以雖然微波輔助酸解與水浴輔助酸解相比，在同等條件下，可以將褐藻糖膠降解到更低分子量，但要注意微波造成的降解產(chǎn)物中硫酸基含量降低的問題。可以通過控制降解時間、酸度、降解溫度等來控制微波對褐藻糖膠硫酸基的破壞，或者將其作為一種制備低分子量褐藻糖膠的前期預處理手段使用。該研究可以為微波輔助酸解褐藻糖膠的應用提供一定的研究依據(jù)。

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