利用AhMITE分子標記對花生雜交F1代的真偽鑒定

徐彪 李玉發 牛海龍 李偉堂 劉紅欣 王偉 吳松權 何中國

摘要 [目的]提高花生育種效率。[方法]從10對AhMITE引物中篩選出對雜交親本具有差異條帶的標記引物，分別對10個花生雜交組合197個F1 代單株進行真偽雜種鑒定。[結果]根據PCR擴增的父母本帶型，共鑒定出75個真雜種單株，真雜種比例為38.02%。[結論]利用AhMITE分子標記可以快速、準確地對花生雜交F1 代進行真偽鑒定，為進一步使用AhMITE分子標記技術對吉林省花生新品種選育及花生種質資源遺傳多樣性分析提供技術支撐。

關鍵詞 花生;F1真偽鑒定;AhMITE標記

中圖分類號 S565.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）11-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.024

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Identification of F1 Generation Peanut Hybrids Using AhMITE Molecular Markers

XU Biao1，2，LI Yu-fa2，NIU Hai-long2 et al

（1.Agricultural College of Yanbian University，Yanji，Jilin 133000;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling，Jilin 136110）

Abstract [Objective]In order to improve the efficiency of flower breeding.[Method]Screened from 10 pairs of AhMITE primers for the marker primers with different bands in the hybrid parents，197 F1 single plants of 10 peanut cross combinations were used to identify the true and false hybrids.[Result]According to the parental band type amplified by PCR，a total of 75 true hybrid single plants were identified，and the true hybrid ratio was 38.02%.[Conclusion]The AhMITE molecular marker can be used to quickly and accurately identify the authenticity of the peanut hybrid F1 generation.It is expected to provide technical support for the further use of the AhMITE molecular marker technology in the selection of new peanut varieties in Jilin Province and the analysis of the genetic diversity of peanut germplasm resources.

Key words Peanut;F1 authenticity test;AhMITE mark

栽培花生 ?（Arachis hypogaea ?Linn.） 是世界上種植最廣泛的食用豆類之一，因其高蛋白質與不飽和油含量而受到重視[1]。雜交育種是花生新品種選育的主要途徑，然而在花生去雄過程中母本的8個雄蕊清除不徹底或不及時，經常會導致F1出現假雜種[2]。傳統表型鑒定花生真偽雜種的方法，對于父母本表型差異較小的雜種很難辨認，而通過分子標記技術鑒定花生F1代真偽雜種極大地提高了鑒別準確性。

微型反向重復轉座子（miniature inverted repeat transposable element，MITE）是 由Bureau等[3]最先在玉米中發現并命名的，且大多數分布于真核組織中。MITE通常在植物基因組中擴增，像DNA 轉座子一樣，擁有TIR和TSD，但不編碼轉座酶[4]。MITE標記技術擴增結果用瓊脂糖凝膠即可鑒定，相比聚丙烯酰胺凝膠鑒定，操作簡單方便，在玉米、水稻等植物上得到有效應用[5-6]。

有關AhMITE在花生上的應用，Patel等[7]利用MITE標記將2種含有插入的突變體與正常油酸花生品種和天然存在的高油酸突變體區分開。Gayathri等[8]從33個不同基因型的花生全基因組重測序數據（WGRS）中鑒定出465個已報道的標記，共獲得2 957個新的AhMITE1標記。Kolekar等[9]使用MITE標記對銹病抗性進行了驗證。王輝等[10]通過AhMITE分子標記技術對115份花生材料進行DNA多態性及聚類分析。以上結果表明，MITE可以廣泛地應用于花生育種，為花生新品種選育及優異種質創制奠定基礎。目前關于利用 AhMITE 轉座子分子標記技術對花生進行真偽鑒定的報道很少，王潔等[11]利用7對轉座子引物對166個F1單株進行鑒定，真雜種比率為47.59%。尹亮等[12]建立了使用雜交種子子葉 DNA并結合AhMITE技術對F1代雜交種進行真偽鑒定技術的研究。

筆者利用10對多態性AhMITE引物對10個花生雜交組合進行F1代真偽雜種鑒定，旨在為吉林省選育花生新品種和種質創新提供技術支撐，同時為今后使用AhMITE分子標記技術進行遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜構建提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 共選用 10個花生雜交組合，共14 份花生F1代親本材料（表1）。親本及 F1代均于2021年5月7日種植于吉林省農業科學院花生育種研究團隊雜交池。

1.2 基因組DNA提取及檢測

采用TIANGEN公司DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒的方法，提取花生基因組DNA，使用超微量分光光度計（Nano Drop 2000）和瓊脂糖電泳檢測DNA質量和濃度，將總DNA稀釋為20 ng/μL，置于-20 ℃保存備用。

1.3 AhMITE標記引物篩選

從文獻[13]中選取10對 AhMITE引物（表2），由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成。利用這10對AhMITE引物對親本進行多態性分析，選出條帶清晰、穩定、有明顯差異的標記用于F1代雜種鑒定。

1.4 PCR擴增程序及擴增產物檢測

PCR反應體系（10 μL）： Taq ?PCR Master Mix 5 μL，AhMITE正向引物（15 μmol/L）1 μL，AhMITE反向引物（15 μmol/L）1 μL，DNA 模板（20 ng/μL）1 μL，其余用ddH2O補足。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s，55～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30個循環;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。 PCR產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，添加0.8 μL Gold View Ⅰ 型核酸染色劑在凝膠分子成像儀器上成像保存。

1.5 真偽雜種鑒定

使用對父母本有多態性的AhMITE引物，對雜種F1代進行PCR擴增，擴增帶型表現為雜合的為真雜種，帶型與母本相同為假雜種。

2 結果與分析

2.1 F1 代群體 DNA 提取 該試驗提取的花生組DNA，經超微量分光光度計檢測OD260/OD280在2.0左右。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，條帶清晰，質量較高，可以用于后續試驗，結果見圖1。

2.2 親本多態性AhMITE標記引物的篩選 該試驗選擇的 10對AhMITE引物在14個雜交親本中均可擴增出條帶。其中，引物 AhTE0544使組合1、4、5、6、7、8、10的雙親條帶具有明顯差異，父母本帶型的分子量在100～500 bp（圖2、3）;AhTE0577 使組合2、3、9的雙親條帶具有明顯差異，父母本帶型的分子量在100～500 bp（圖4、5）。因此選用AhTE0544和AhTE0577 引物對14個雜交親本F1代進行真偽鑒定。

2.3 F1后代真偽雜種鑒定

篩選出對父母本有顯著差異的AhMITE標記引物，分別對10個花生雜交組合進行真偽雜種鑒定。擴增條帶僅表現為父本或者母本的為偽雜種，表現為雜合帶型的為真雜種。部分鑒定結果見圖3、5～6，10個雜交組合的真雜種比例見表1。其中，第5個組合真雜種率最高，達47.37%，第1個組合真雜率最低，僅25.00%，10個雜交組合平均真雜種比例為38.02%。

3 討論

花生雜交是選育優異新品種和種質創新最常用、最簡單的方法之一[14]。為了提高雜交群體的質量，對雜種F1代進行準確鑒定至關重要。由于花生染色體數目和基因型差異較大，導致花生不同品種間表型上差異也較大[15]。在分子標記未被廣泛應用之前，對于F1代真偽雜種的鑒定基本采用形態標記法，費時費力，且準確性不高。分子標記的鑒定不受外界環境的制約，直接反應不同品種間差異，在作物早期即可鑒定[16]。花生F1雜種鑒定大多采用簡單重復序列（SSR）標記，鑒定結果較好，但是制作聚丙酰胺凝膠及跑膠過程較為復雜。此外，利用SNP位點進行鑒定，準確性高，但是對于DNA濃度要求極高[17]。該試驗利用AhMITE轉座子標記技術對F1雜種進行真偽鑒定，AhMITE重復性好，穩定性高，易操作，極大地提高了鑒定效率。

近年來，祁雪等[18]采用原位胚拯救技術并利用MITE轉座子分子標記對F1代進行鑒定，真雜種率為44.3%;和小燕等[19]采用SNP位點突變堿基G-T、籽仁表型性狀、SSR多態性標記分析、四引物擴增突變體系PCR和Sanger測序基因峰值圖分析4種方法對F1代進行真偽雜種鑒定;寧龍龍等[20]利用AhMITE轉座子標記對F1后代群體78個單株進行了鑒定，真雜種率為25.64%;仇靜靜等[21]利用MITE轉座子和SSR標記對各雜交組合的F1代雜交種進行真偽檢測，254粒雜交F1中共鑒定出96粒真雜交種。

4 結論

該研究利用AhMITE分子標記可以快速、準確地對花生雜交F1 代進行真偽鑒定，可極大地提高花生育種效率，也可為進一步使用AhMITE分子標記技術對吉林省花生新品種選育及花生種質資源遺傳多樣性分析奠定理論基礎。

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