N-糖基化修飾對(duì)異源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的作用研究進(jìn)展

韓銘海 王未鮮 于志海

摘要 畢赤酵母是目前工業(yè)上生產(chǎn)重組蛋白最常用的宿主之一，而蛋白高水平表達(dá)技術(shù)一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，成熟的分子生物學(xué)技術(shù)手段使改造N-糖基化修飾位點(diǎn)成為一種操作性較強(qiáng)的提高目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的策略。綜述了畢赤酵母中蛋白N-糖鏈的結(jié)構(gòu)、其介導(dǎo)的CNX循環(huán)和對(duì)蛋白折疊的作用以及通過(guò)N-糖基化修飾位點(diǎn)改造促進(jìn)蛋白表達(dá)的應(yīng)用研究。

關(guān)鍵詞 畢赤酵母;N-糖基化修飾;異源蛋白;蛋白折疊

中圖分類(lèi)號(hào) Q78? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）11-0014-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.005

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research Progress on the Effect of N-glycosylation on Production of Heterologous Proteins in ?Pichia pastoris

HAN Ming-hai，WANG Wei-xian，YU Zhi-hai

（Guizhou Institute of Technology，Guiyang，Guizhou 550000）

Abstract ?Pichia pastoris ?is one of the most popular eukaryotic hosts for producing heterologous proteins.However，increased secretion of certain proteins valued for their applications is essential in this field.Due to promoted techniques in molecule biology，engineering N-glycosylation sites of target proteins was easily manipulated and an effective way to increase their productions.This paper reviewed the structure of N-glycan of glycoproteins in ?Pichia pastoris， the effect of its participation in CNX cycle on protein folding，and engineering N-glycosylation sites of the target proteins for stimulating their productions.

Key words ?Pichia pastoris; N-glycosylation;Heterologous protein;Protein folding

畢赤酵母（ Pichia pastoris，最新分類(lèi)名為Komagataella pastoris或Komagataella phaffii） 是科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)蛋白類(lèi)產(chǎn)品最常用的表達(dá)宿主。這種蛋白表達(dá)宿主具有高密度細(xì)胞培養(yǎng)、高效而可控的啟動(dòng)子、蛋白翻譯后修飾、異源蛋白高效分泌表達(dá)、胞外蛋白易于分離和純化以及公認(rèn)的安全性等優(yōu)點(diǎn)[1]，是當(dāng)今最受歡迎的蛋白表達(dá)體系之一[2]。

獲得高水平表達(dá)一直是商業(yè)化生產(chǎn)蛋白類(lèi)產(chǎn)品的重要前提條件之一。當(dāng)前，提高畢赤酵母蛋白表達(dá)水平的主要技術(shù)有：一是發(fā)酵條件優(yōu)化策略，包括培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化、誘導(dǎo)策略?xún)?yōu)化和高密度培養(yǎng)等傳統(tǒng)手段[3];二是分子生物學(xué)技術(shù)，如優(yōu)化密碼子、選用強(qiáng)啟動(dòng)子和高效的信號(hào)肽、增加基因拷貝數(shù)等[3-4];三是改造蛋白、折疊、修飾和分泌途徑，以提高細(xì)胞蛋白合成速度和產(chǎn)量[3-4]，如通過(guò)共表達(dá)分子伴侶和PDI[5-6]等來(lái)提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)異源蛋白的加工和折疊。近期的研究表明，在宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊或是折疊的低效性是抑制某些異源蛋白高效表達(dá)的重要原因之一[7-10]。

1 新生肽高效折疊是其高水平表達(dá)的關(guān)鍵

在真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中，種類(lèi)和數(shù)量較多的分子伴侶和輔助因子參與了新生肽的折疊加工，而細(xì)胞嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制（quality control）機(jī)制確保了多肽的正確折疊，該復(fù)雜機(jī)制的低效性常常成為宿主表達(dá)蛋白的限速步驟[7-10]。另外有研究表明，通過(guò)采用優(yōu)化啟動(dòng)子或增加基因拷貝數(shù)等策略，可以促進(jìn)畢赤酵母表達(dá)外源蛋白，但相當(dāng)含量的蛋白仍然滯留在胞內(nèi)而未被分泌表達(dá)。究其原因，可能是蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不能快速折疊，致使大量未折疊多肽聚集，這是限制蛋白高效分泌表達(dá)的主要因素[7-10]。肽鏈在ER中合成只需數(shù)十秒至幾分鐘，而新生肽在ER中停留時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十分鐘，最終，只有正確折疊的多肽才能被細(xì)胞輸送至高爾基體，接受進(jìn)一步的修飾加工，非正確折疊蛋白被ER識(shí)別并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)降解途徑（ERAD），被泛素綴合酶修飾，最終在細(xì)胞質(zhì)中被蛋白酶體徹底消化[5，7，9]。因此，提高新生肽折疊效率對(duì)蛋白的高水平表達(dá)至關(guān)重要。有研究表明，N-糖基化修飾對(duì)新生肽折疊有重要作用[11-12]。

2 N-糖基化修飾對(duì)蛋白表達(dá)的作用

一般來(lái)說(shuō)，N-糖基化修飾參與了蛋白質(zhì)合成折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，有助于酵母中蛋白質(zhì)的高效表達(dá)和分泌[13-14]。其作用主要有以下幾個(gè)方面：第一，沒(méi)有N-糖鏈的協(xié)助將可能會(huì)嚴(yán)重影響新生肽折疊的效率，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)多肽的低效折疊將會(huì)被嚴(yán)格的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制體系所識(shí)別，從而可能進(jìn)入ERAD途徑而被降解[15];第二，N-糖鏈上的甘露糖可以與ERGIC-53結(jié)合。ERGIC-53是一種甘露糖凝集素受體，在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白到高爾基體的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16];第三，N-糖鏈可有效地屏蔽多肽表面的疏水性區(qū)域從而抑制蛋白的聚集[17]。

2.1 畢赤酵母中糖蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)

自然界中，蛋白糖基化修飾主要有兩類(lèi)：N-糖基化修飾和O-糖基化修飾[18]。在原核和真核生物中，O-糖基化是蛋白常見(jiàn)的翻譯后修飾方式，在酵母細(xì)胞中，O-糖基化主要形式是絲氨酸和蘇氨酸羥基被O-甘露糖基化修飾[18]。畢赤酵母中蛋白O-糖基化修飾廣泛存在，但沒(méi)有N-糖基化修飾普遍[19]。

N-糖基化修飾是指β-構(gòu)型的N-乙酰葡糖胺異頭碳與天冬酰胺的γ-酰胺N原子共價(jià)鏈接而成的N-糖苷鍵修飾[20]。在自然界中，蛋白氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr（Asn為天冬酰胺、Xaa是除了Pro以外任意氨基酸、Ser為絲氨酸、Thr為蘇氨酸）中，高達(dá)70%～90%的天冬酰胺殘基是被糖基化修飾的[21]。

根據(jù)結(jié)構(gòu)差異，N-糖鏈可分為3類(lèi)：高甘露糖型、復(fù)雜型和雜合型[20-21]。畢赤酵母中N-糖鏈?zhǔn)歉吒事短切停╤igh mannose）（圖1），85%的N-糖鏈的結(jié)構(gòu)為GlcNAc2Man8-14（GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，Man表示甘露糖），而GlcNAc2Man2為畢赤酵母中糖蛋白N-糖鏈最典型的結(jié)構(gòu)[21]。

2.2 N-糖鏈對(duì)蛋白折疊的作用 一般說(shuō)來(lái)，N-糖基化修飾促進(jìn)蛋白折疊有兩種機(jī)制[22-23]。

2.2.1

N-糖鏈起分子伴侶的作用。一般說(shuō)來(lái)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，疏水作用是引起蛋白折疊的驅(qū)動(dòng)力，非折疊狀態(tài)的蛋白的表面比天然活性狀態(tài)的蛋白的表面具有更多的疏水區(qū)域，這使得非折疊狀態(tài)的蛋白在細(xì)胞中擁擠的環(huán)境中易于發(fā)生聚集。目前，研究者普遍認(rèn)可的關(guān)于N-糖基化修飾促進(jìn)蛋白折疊的一種機(jī)理是：由于N-糖鏈?zhǔn)怯H水基團(tuán)，肽鏈的N-糖基化能夠避免修飾位點(diǎn)附近與其他蛋白發(fā)生的疏水作用，提高了蛋白折疊的可逆性，從而促進(jìn)了蛋白的折疊[11]。

2.2.2 N-糖鏈介導(dǎo)新生肽參與鈣聯(lián)蛋白（CNX）循環(huán)。基于作用機(jī)制的差異性，ER中分子伴侶系統(tǒng)可以分為2類(lèi)：①經(jīng)典分子伴侶系統(tǒng)（classical chaperones），主要是熱休克蛋白類(lèi)，存在于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，直接作用于多肽鏈，例如Bip（酵母中為Kar2p）、PDI和PPI等[23-24];②CNX循環(huán)系統(tǒng)，包括了鈣聯(lián)蛋白（CNX）和鈣網(wǎng)蛋白（CRT，酵母沒(méi)有鈣網(wǎng)蛋白），屬于凝集素分子伴侶，特異性地存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，招募ERp57、UGGT、CypB等蛋白與N-糖鏈結(jié)合發(fā)生作用，通過(guò)CNX循環(huán)，促進(jìn)新生肽蛋白的折疊（圖2）。同時(shí)，這些蛋白也具有經(jīng)典分子伴侶的某些功能[23-24]。

2.3 N-糖鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工及介導(dǎo)CNX循環(huán)

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST）轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)為Glc3Man9GlcNAc2的糖鏈到新生肽N-糖基化位點(diǎn)（Asn-Xaa-Ser/Thr）的天冬酰胺殘基上，此糖鏈依次被α-葡糖苷酶I和α-葡糖苷酶II切除最末端的兩個(gè)葡萄糖，形成GlcMan9GlcNAc2結(jié)構(gòu)（圖1）[21]，此結(jié)構(gòu)的糖鏈被CNX（酵母中為Cne1p蛋白）和CRT（酵母細(xì)胞中不存在這種蛋白）識(shí)別并結(jié)合[23-24]。CNX與新生肽結(jié)合后，招募ERp57和CypB（Cyclophilin B）等蛋白協(xié)同作用促進(jìn)多肽的折疊。ERp57屬于二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）家族，CypB屬于肽基脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）家族，分別催化二硫鍵改組和脯氨酸異構(gòu)化過(guò)程，是多數(shù)蛋白折疊過(guò)程中的限速步驟。α-葡糖苷酶II切除糖鏈末端的第三個(gè)葡萄糖，該切除過(guò)程速度小于切除第二個(gè)葡萄糖的速度，得到Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)的糖鏈，其與CNX結(jié)合較弱，導(dǎo)致新生肽與CNX脫離（圖2），得到游離新生肽。如果游離新生肽正確折疊，將會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，接受下一步的修飾和加工，而未正確折疊的新生肽將會(huì)被糖基轉(zhuǎn)移酶（UGGT）識(shí)別，并且催化糖鏈重新添加葡萄糖，再次得到GlcMan9GlcNAc2結(jié)構(gòu)，并再次結(jié)合CNX，即又獲得再次折疊的機(jī)會(huì)[23-24]。經(jīng)過(guò)多次CNX循環(huán)而未獲得活性結(jié)構(gòu)的多肽，其糖鏈結(jié)構(gòu)中的甘露糖將被α-甘露糖苷酶水解（圖1），這將阻止UGGT與新生肽結(jié)合，導(dǎo)致新生肽被淘汰出該CNX循環(huán)（圖2），最終被細(xì)胞的ERAD通路降解[23-24]。

3 畢赤酵母中N-糖基化修飾對(duì)蛋白表達(dá)作用的研究

3.1 N-糖基化修飾促進(jìn)異源蛋白表達(dá)

較多研究表明，N-糖基化修飾對(duì)蛋白表達(dá)是有促進(jìn)作用的。Han等[25]報(bào)道，去除彈性蛋白酶Asn-43、Asn-212和Asn-280位點(diǎn)的N-糖基化修飾，分別降低了其在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)水平的23.9%、63.6%和63.7%。Yang等[26]也報(bào)道，去除脂酶Asn-60位點(diǎn)的N-糖基化修飾完全抑制了其在畢赤酵母GS115中的表達(dá)。另外有研究表明，雞蛋卵清蛋白Asn-292的N-糖基化修飾對(duì)其在畢赤酵母中的折疊和高水平表達(dá)至關(guān)重要，而Asn-311位點(diǎn)的N-糖基化修飾對(duì)其表達(dá)作用不明顯[27]。在角質(zhì)酶和美洲駝VHH抗體片段引入N-糖基化修飾可促進(jìn)其在畢赤酵母中的折疊和表達(dá)，而在蛋白的N端引入N-糖基化修飾比在C段的效果更好[28]。Wei等[29]通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，Asn-224位點(diǎn)的N-糖基化修飾對(duì)于真菌β-葡糖苷酶在畢赤酵母中折疊和高水表達(dá)也是必須的。Wang等[30]報(bào)道了破傷風(fēng)毒素片段C蛋白的表達(dá)水平與其N(xiāo)-糖基化修飾水平也呈負(fù)相關(guān)。

另外，某些蛋白前導(dǎo)肽上的N-糖基化修飾對(duì)前導(dǎo)肽的切除和成熟蛋白的分泌也有著重要的作用。Han等[31]報(bào)道，在彈性蛋白酶前導(dǎo)肽Asn-51和Asn-93位置引入N-糖基化位點(diǎn)分別提高了其在畢赤酵母中表達(dá)量的104%和57%。Liu等[32]也報(bào)道，除去脂肪酶前導(dǎo)肽上的N-糖基化修飾則抑制了其在畢赤酵母中的表達(dá)。可以推測(cè)，前導(dǎo)肽上的N-糖基化修飾可能對(duì)蛋白的成熟和折疊以及分泌表達(dá)起著非常重要的作用。

3.2 N-糖基化修飾抑制異源蛋白表達(dá)

研究表明，蛋白的N-糖基化修飾對(duì)其表達(dá)有著負(fù)面影響。例如，Hoshida等[33]報(bào)道去除α-淀粉酶所有的N-糖基化位點(diǎn)提高了其在釀酒酵母中表達(dá)量的3倍;在破傷風(fēng)毒素片段C蛋白Asn-320引入N-糖基化位點(diǎn)也抑制了其在畢赤酵母中的表達(dá)[30]。Han等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在彈性蛋白酶Asn-67位點(diǎn)引入N-糖基化位點(diǎn)則完全抑制了其在畢赤酵母中的表達(dá)。

3.3 N-糖基化修飾對(duì)異源蛋白表達(dá)影響不顯著

研究表明，一些蛋白的N-糖基化修飾與其分泌表達(dá)水平幾乎沒(méi)有關(guān)系。Ito等[27]報(bào)道了卵清蛋白Asn-311位點(diǎn)的N-糖基化修飾不影響其在釀酒酵母中的分泌表達(dá);Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，尿激酶的N-糖基化修飾對(duì)其在畢赤酵母中的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。

3.4 提高N-糖基化位點(diǎn)的修飾效率促進(jìn)異源蛋白表達(dá)

研究者通過(guò)定點(diǎn)突變的技術(shù)可以研究異源蛋白上N-糖基化修飾對(duì)其表達(dá)水平的影響，也可以去除或引入N-糖基化修飾位點(diǎn)以提高其表達(dá)水平。一旦確定有利的N-糖基化修飾位點(diǎn)，那么可以通過(guò)采用更高效的N-糖基化修飾序列Asn-Xaa-Thr替代Asn-Xaa-Ser以提高特定位點(diǎn)的N-糖基化修飾效率，以此來(lái)增強(qiáng)N-糖基化修飾促進(jìn)蛋白的效應(yīng)。Han等[36]通過(guò)這種策略提高了彈性蛋白酶的N-糖基化修飾水平，而且也提高了其在畢赤酵母中的表達(dá)水平。另外，在N-糖基化修飾序列上游特定位點(diǎn)引入芳香族氨基酸序列也可以有效地提高N-糖基化位點(diǎn)的修飾效率[37-38]，可以推測(cè)，通過(guò)這種提高N-糖基化修飾效率的策略也可有效地促進(jìn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

4 展望

畢赤酵母是目前工業(yè)上生產(chǎn)異源蛋白最常用的宿主，提高異源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)水平的新技術(shù)、新策略一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。N-糖基化修飾是畢赤酵母細(xì)胞中最常見(jiàn)的翻譯后修飾，N-糖鏈作為蛋白折疊的凝集素分子伴侶，介導(dǎo)新生肽參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊質(zhì)量控制以及轉(zhuǎn)運(yùn)，因此對(duì)蛋白表達(dá)水平有著重要的影響。通過(guò)成熟分子生物學(xué)技術(shù)，研究者可以便捷地在目標(biāo)蛋白的氨基酸序列中添加或是去除N-糖基化修飾位點(diǎn)，以研究其對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響。已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了通過(guò)引入N-糖基化修飾位點(diǎn)提高目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的研究，因此，通過(guò)N-糖基化修飾位點(diǎn)的改造是一種有效地提高目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的策略。

另外，目前關(guān)于N-糖基化修飾作用于蛋白折疊表達(dá)的理論還不夠完善，存在一定的不足。例如，CNX循環(huán)作用于新生肽的折疊過(guò)程與其N(xiāo)-糖鏈的蛋白位點(diǎn)特異性沒(méi)有關(guān)聯(lián)性，而實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)，某些蛋白的不同位點(diǎn)N-糖鏈對(duì)其表達(dá)的作用是截然不同的。這些問(wèn)題還有待研究者做進(jìn)一步的研究以繼續(xù)完善相關(guān)的理論，從而進(jìn)一步優(yōu)化通過(guò)N-糖基化位點(diǎn)改造促進(jìn)蛋白表達(dá)的策略。

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