黃水芽胞桿菌抗逆性潛力挖掘及乙醇耐受機制分析

程坤，劉蕊，鄭佳，翟磊，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)

濃香型白酒是中國白酒典型代表之一，市場份額占全國白酒總量的70%以上[1]。根據GB/T 10781.1—2006 《濃香型白酒》，濃香型白酒以糧谷為原料，經傳統固態發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，未添加食用酒精及非白酒發酵產生的呈香物質，以已酸乙酯為主體復合香。微生物在白酒釀造過程中發揮重要作用，處于核心地位，能夠產生多種生物酶和香味成分及其前體物質，參與淀粉糖化、酒精發酵、產酯生香等生化過程，對白酒獨特風味的形成具有重要作用[2]。

抗逆性是釀造微生物適應白酒發酵過程、發揮功能特性的基礎。芽胞桿菌是白酒發酵過程中大曲、窖泥和酒醅中的優勢類群，在大曲發酵的中后期開始大量繁殖，并成為優勢種群。與其他微生物相比，芽胞桿菌除具有產生生物酶、氨基酸、風味物質等代謝物功能特性外，通常具有耐酸、耐鹽、耐高溫、耐膽鹽等顯著特征[3-4]，以適應復雜多變的發酵生產環境。黃水是固態發酵生產濃香型大曲酒的副產物，為棕黃色黏稠液體，含有多種酸類、醇類等呈香味物質以及經過長期馴化的有益微生物[5]。實驗室前期從四川省宜賓地區傳統發酵濃香型白酒的黃水樣品中分離到1株黃水芽胞桿菌(Bacillusaquiflavi)3H-10[6]，具有較好的產蛋白酶活力，可產生苯甲醛、正丁醇、已酸乙酯等多種代謝風味物質，且通過全基因組測序分析顯示，菌株在抗生素耐藥性、產毒與致病性方面風險較低。本研究對黃水芽胞桿菌3H-10進一步開展乙醇、酸、堿、NaCl和溫度等耐受性潛力挖掘，并結合菌種全基因組序列分析解析菌種潛在耐受機制，為該菌株應用于濃香型白酒發酵的實際生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

本研究所用黃水芽胞桿菌3H-10分離自四川省宜賓地區傳統發酵濃香型白酒的黃水樣品，保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 24755。菌種所使用的培養基為大豆酪蛋白(tryptic soy broth，TSB)培養基和大豆酪蛋白瓊脂(tryptose soya agar，TSA)固體培養基，北京陸橋技術有限公司。

1.1.2 試劑與設備

無水乙醇，天津市致遠化學試劑有限公司；NaCl，西隴化工股份有限公司。

BHG-8082型恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Eppendorf微量可調移液器、5424R型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；HG-50型高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；AC2-4S1型生物安全柜，新加坡Esco公司；FE20型pH計，梅特勒-托利多食品(上海)有限公司；2000型分光光度計，尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備

挑取新鮮培養的單菌落接種到4 mL TSB培養基中，37 ℃，200 r/min培養3 d后作為接種種子液。

1.2.2 乙醇耐受性測定

將種子液按1%接種量分別接種于乙醇體積分數為0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的TSB培養基中，37 ℃ 200 r/min培養3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結果。每個乙醇含量條件設置3個重復。以不接種的TSB液體培養基作為空白對照。

1.2.3 酸、堿耐受性測定

將種子液按1%接種量分別接種于pH 2、4、6、8、10、12的TSB培養基中，37 ℃ 200 r/min培養3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結果。每個pH條件設置3個重復。以不接種的TSB培養基作為空白對照。

1.2.4 NaCl耐受性測定

將種子液按1%接種量分別接種于NaCl質量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160 g/L的TSB液體培養基中，37 ℃ 200 r/min培養3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結果。每個NaCl質量濃度條件設置3個重復。以不接種的TSB培養基作為空白對照。

1.2.5 溫度耐受性測定

取20 μL種子液接種至TSA固體培養基，分別置于4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃培養3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結果。每個溫度條件設置3個重復。

1.2.6 基因功能注釋

從NCBI數據庫下載黃水芽胞桿菌3H-10基因組序列(登錄號CP082780)，使用RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology, https://rast.nmpdr.org/)annotation server在線分析工具進行基因功能注釋。其中，RAST注釋方案選擇“RASTtk”，并勾選“Automatically fix errors”選項，其余參數均使用默認設置。

1.2.7 菌種乙醇代謝途徑KEGG分析

將下載的黃水芽胞桿菌3H-10基因組序列在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, https://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)在線網站[7]進行代謝途徑分析，查找菌株乙醇代謝途徑及相關基因。

1.2.8 潛在乙醇耐受基因的靶向檢測

通過文獻檢測已報道的與乙醇耐受相關基因，并從NCBI nucleotide數據庫下載相應基因序列，使用本地比對工具blastv2.2.21在基因組序列中進行序列比對，定向檢測黃水芽胞桿菌3H-10基因組是否存在已報道的與乙醇耐受相關的基因。

2 結果與分析

2.1 黃水芽胞桿菌3H-10對乙醇的耐受性

試驗結果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對乙醇的耐受范圍為0～4%，最適生長乙醇體積分數為0，說明該菌株對乙醇有一定的耐受性。乙醇為半極性溶劑，其性能介于極性與非極性溶劑之間，對細胞的毒性主要表現為增加質膜的流性，破壞膜蛋白的功能[8]。乙醇耐受性能夠維持菌體在乙醇脅迫下保持正常生長。黃水芽胞桿菌3H-10分離自濃香型白酒發酵過程的黃水樣品，后者富含醇類、酸類等呈香味物質[5]，推測該菌株的乙醇耐受性是其與環境相適應的結果，有助于菌種在發酵過程中維持存活、生長繁殖并發揮功能特性。

2.2 黃水芽胞桿菌3H-10對酸、堿的耐受性

試驗結果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對酸堿的耐受范圍為pH 6.0～10.0，最適pH 8.0。在pH 1.0～5.0環境中生長、但pH>5.5時不能生長的微生物稱為嗜酸微生物；將最適生長pH>9.0的微生物稱為嗜堿微生物；將能在高pH條件下生長，但最適值并不在堿性pH范圍內的微生物稱為耐堿菌[9]。黃水芽胞桿菌3H-10對堿性環境具有輕微耐受性。

2.3 黃水芽胞桿菌3H-10對NaCl的耐受性

試驗結果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對NaCl的耐受范圍為0～20 g/L，最適生長NaCl質量濃度為0 g/L。根據Kushner的分類原則，一般將最適生長NaCl濃度為0.5～2.5 mol/L、2.5～5.2 mol/L的微生物分別稱為中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌[10]。黃水芽胞桿菌3H-10對NaCl無顯著耐受性。

2.4 黃水芽胞桿菌3H-10對溫度的耐受性

試驗結果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對溫度的耐受范圍為20～45 ℃，最適生長溫度為37 ℃。通常最大生長溫度>50 ℃的微生物為嗜熱菌，將在溫度<10 ℃時才能生長的微生物為嗜冷菌[9]。黃水芽胞桿菌3H-10對溫度無顯著耐受性。

2.5 黃水芽胞桿菌3H-10基因注釋分析

使用RAST annotation server對菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組進行注釋。結果顯示，該菌株基因組大小為3 806 094 bp，G+C含量為35.70 mol%，預測到4 097個蛋白質編碼基因。蛋白質編碼基因經注釋可歸為27個類別(圖1)，其中與氨基酸及其衍生物，蛋白質代謝，碳水化合物代謝，輔助因子、維生素、輔基和色素相關的基因較多，分別為331、215、172和166個，推測黃水芽胞桿菌3H-10對氨基酸、蛋白質、碳水化合物等基礎物質的代謝能力較旺盛。其中，注釋到26個與應激反應相關的基因，分別與氧化應激、滲透調節、解毒和周質壓力等相關。

圖1 利用RAST工具對黃水芽胞桿菌3H-10基因注釋的結果Fig.1 Gene annotation result of B.aquiflavi 3H-10 with RAST

進一步分析發現，黃水芽胞桿菌3H-10基因組中含有15個熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)基因，可編碼產生HSP90、HSP20、HSP33、GroES、GroEL、ClpB、Hfq、CopZ、DnaJ和DnaK等HSP(表1)。

表1 菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組中的熱休克蛋白基因Table 1 Genes encoding for heat shock proteins in the genome of B.aquiflavi 3H-10

HSP是生物受到環境中物理、化學和生物等刺激時發生應激反應而合成的一類高度保守的糖蛋白，普遍存在于原核和真核生物中。生物體或組織受到應激刺激后，需要度過一個絕對恢復期，細胞在此期間合成HSP，其后才能耐受應激刺激，當超出一定期限時，HSP便會失去保護作用[11]。匡素芳等[12]發現，當丙酮丁醇梭菌過量表達相應編碼應激反應蛋白基因groESL、grpE和htpG時，重組菌的丁醇耐受性大大提高。MIAO等[13]研究發現，東方伊薩酵母的分子伴侶HSP 90、HSP70等相關基因在乙醇環境脅迫下轉錄水平顯著上調。李偉麗等[14]通過將超嗜熱菌強烈火球菌的小分子HSP基因sHsp導入枯草芽胞桿菌中表達，使菌株對乙醇的耐受性顯著增強。黃水芽胞桿菌3H-10基因組中檢測到數量和種類較多的HSP編碼基因，這有利于菌株在乙醇等不良環境中維持細胞存活、生長繁殖并發揮功能。

2.6 黃水芽胞桿菌3H-10乙醇代謝途徑分析

KEGG分析顯示，菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組中含有1個乙醇脫氫酶基因adh和3個乙醛脫氫酶基因aldh，分別編碼乙醇脫氫酶[(alcohol dehydrogenase，ADH), EC1.1.1.1]和乙醛脫氫酶[(aldehyde dehydrogenase，ALDH), EC.1.2.1.3]，組成較完整的乙醇脫氫酶系(圖2)。ADH和ALDH參與催化乙醇的分解代謝，乙醇通過ADH氧化成為乙醛，乙醛通過ALDH氧化成為乙酸，乙酸進入檸檬酸循環，最終氧化成CO2和水。其中，ADH是乙醇代謝的重要限速酶之一，一般為以氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)、氧化型輔酶II(NADP+)或吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)為輔酶的鋅金屬酶，具有廣泛的特異性，是許多有機體中短鏈醇代謝的關鍵酶，可逆催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應的羧基化合物。ALDH是生物體內用于降解乙醛的重要酶類，以NADP+為輔酶的含鋅類酶，催化包括乙醇在內的某些物質以及二級醇、醛和酮的脫氧反應。ADH和ALDH廣泛存在于微生物、植物和動物體中，其代謝活性直接影響生物體內乙醇的代謝，從而對生物體的生理狀態產生直接影響。鞠建松等[15]將假堅強芽胞桿菌中adh和aldh進行克隆并異源表達，能夠較大程度提高宿主對乙醇的耐受性。此外，黃水芽胞桿菌3H-10基因組中還含有1個乙醛脫氫酶(EC1.2.1.10)，可催化乙醛生成乙酰輔酶A，后者進入檸檬酸循環，協助促使乙醇代謝，最終氧化成CO2和水。

圖2 黃水芽胞桿菌3H-10中的乙醇代謝途徑Fig.2 The alcohol metabolism pathway in B.aquiflavi 3H-10

2.7 黃水芽胞桿菌3H-10乙醇耐受相關基因的定向檢索

目前關于芽胞桿菌乙醇耐受性的研究仍相對較少，微生物類群以枯草芽胞桿菌[14-15]為主。具有乙醇耐受特性的微生物當前主要集中在釀酒酵母[16-19]、大腸埃希氏菌[20-21]和惡臭假單胞菌[22]等，其耐受乙醇的機制主要包括：(1)提高糖類和氨基酸等轉運能力；(2)利用排出泵將有機溶劑排出細胞；(3)合成和積累海藻糖與脯氨酸等，減少膜的滲透性改變；(4)合成氨基酸等。將相關基因在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中進行序列比對，結果顯示該菌株不含有這些基因(表2)。說明上述機制不是黃水芽胞桿菌3H-10耐受乙醇的主要原因。

表2 已報道的乙醇耐受相關基因在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中的檢測結果Table 2 The detection result of reported genes related with alcohol tolerance in the genome of B.aquiflavi 3H-10

芽胞桿菌作為白酒發酵過程中的重要微生物類群往往對乙醇等極端環境具有一定耐受性，對其機制的研究能夠為菌株應用于實際生產奠定基礎，值得深入探討。本研究首次對我國四川省宜賓地區首株釀酒微生物新種菌株黃水芽胞桿菌3H-10乙醇耐受機制進行解析，為后續相關研究提供了參考。

3 結論

黃水芽胞桿菌3H-10是從濃香型白酒發酵樣品黃水中分離的1株芽胞桿菌，具有顯著的產蛋白酶和產風味物質能力，在抗生素耐藥性、產毒與致病性方面安全性風險較低，在白酒發酵過程中具有較好的潛在應用價值。本文從乙醇、酸、堿、NaCl和溫度等方面對黃水芽胞桿菌3H-10的抗逆性潛力進行挖掘，并探究其抗逆性潛在機制。結果顯示，菌株可在4%乙醇環境生長，對乙醇具有一定耐受性。基因分析發現，菌株含有數量較多的HSP編碼基因，可通過應激反應減弱乙醇對細胞的毒害作用；菌株基因組中含有完整的乙醇代謝途徑相關基因，可將乙醇依次氧化生成乙醛、乙酸，后者進入檸檬酸循環，最終生成CO2和水。因此，豐富的HSP和完整的乙醇代謝途徑是黃水芽胞桿菌3H-10耐受乙醇的主要原因。研究為黃水芽胞桿菌3H-10應用于濃香型白酒發酵的實際生產奠定了理論基礎。