微小RNA-22對髓母細胞瘤細胞惡性生物學行為的影響及其機制▲

潘思安 黃永凱 歐陽倩 朱瀟鵬

(湖南省株洲市中心醫院1 康復治療科，2 神經外科，株洲市 412000，電子郵箱：rpfdkm@163.com)

髓母細胞瘤屬后顱窩惡性膠質瘤，占兒童腦腫瘤的8%～10%，是兒童常見的惡性神經系統腫瘤之一，患兒常有顱壓增高、頭痛、嗜睡、厭食、惡心、嘔吐等表現，腫瘤壓迫小腦時可出現共濟失調現象[1-2]。目前，臨床上常采用手術、顱脊髓照射和化療等方法治療髓母細胞瘤，雖然這些方法可顯著提高患者生存率，延長生存期，但仍有約三分之一的患者在確診后5年內死亡，而且現有療法的長期副作用明顯，可引起患者神經認知和聽力受損、內分泌功能障礙、繼發惡性腫瘤的發生率增加等情況[3-4]。因此，尋找新的治療方法治療髓母細胞瘤是臨床亟待解決的關鍵問題。微小RNA是指長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，主要通過與目的基因的3′非翻譯區結合從而調控mRNA翻譯，可作為候選生物標志物用于疾病的診斷和治療[5-6]。多項研究表明，微小RNA-22(microRNA-22,miR-22)在乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、胃癌等惡性腫瘤中的表達下調，具有腫瘤抑制作用[7-8]。但關于miR-22在髓母細胞瘤發生和發展中作用的研究報告較少，其調節作用機制尚未清楚。故本研究通過觀察miR-22對髓母細胞瘤細胞惡性生物學行為的影響,并基于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路分析其潛在的作用機制，為髓母細胞瘤的治療尋找新的靶標。

1 材料和方法

1.1 細胞來源與培養 人髓母細胞瘤細胞系UW402、UW473、DAOY和ONS-76細胞，以及正常人神經細胞RGC-5細胞，均購自美國ATCC公司。將細胞培養于含有10%胎牛血清的杜氏改良伊戈爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)，培養條件為37℃、飽和溫度、5% CO2。每2～3 d傳代一次，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2 實驗動物 20只無特定病原體級6周齡雄性BALB/c裸鼠，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號碼：SCXK(京)2017-0011]。飼養條件：室溫(22±1)℃，濕度(50±10)%，每天定時換氣，保持12 h：12 h光暗照明，自由進食、飲水。

1.3 試劑與儀器 DMEM培養基(貨號：31600)、細胞計數檢測(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(貨號：CA1210)、Transwell小室(貨號：G4740)、基質膠(貨號：M8370)、結晶紫染液(貨號：C8470)、胎牛血清(貨號：S9020)、青鏈霉素混合液(100×，貨號：P1400)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(貨號：T1300)、TRIzol裂解液(貨號：R1100)、膜聯蛋白Ⅴ(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒(貨號：CA1020)、RIPA裂解液(貨號：R0010)、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒(貨號：PC0020)均購自北京索萊寶科技有限公司；吉姆薩染色試劑盒(貨號：E607314)購自上海生工生物工程股份有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒(貨號：11668027)、RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(貨號：K1622)購自美國ThermoFisher公司；實時熒光PCR引物、miRNA NC/mimics由廣州銳博生物科技有限公司合成；PI3K、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K，p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)兔單抗購自美國CST公司(批號：4249、17336、4691、4060)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自英國Abcam公司(批號：ab181602、ab205718)；740Y-P(PI3K激動劑)購自大連美侖生物技術有限公司。IX53型顯微鏡購自日本奧林巴斯；TGL16MB型高速冷凍離心機購自長沙湘智離心機儀器有限公司；ELx800型酶標儀購自美國Bio-Tek公司；CytoFLEX S流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀購自北京六一儀器廠；G:BOX型多功能凝膠成像系統購自Syngene公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實時定量PCR法檢測細胞miR-22表達水平：取對數生長期的W402、UW473、DAOY、ONS-76和RGC-5細胞，胰酶消化、2 000 r/min離心15 min后收集細胞沉淀，加入適量TRIzol裂解液提取細胞總RNA，檢測RNA濃度和純度后，按照反轉錄試劑盒說明書的步驟將RNA反轉錄為cDNA。PCR反應體系包括dNTPs 0.5 μL、5×Buffer 5 μL、Taq酶0.3 μL、MgCl21.5 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL，加去離子水至總體積為25 μL。反應參數為95℃ 5 min，95℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s，重復40個循環，最后72℃ 10 min，4℃ 5 min終止反應。以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt的方法計算目的基因相對表達水平，實驗重復3次。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列

1.4.2 細胞轉染及分組：收集對數生長期的DAOY細胞，以5×105個/孔接種到6孔板中，加入DMEM培養基。將DAOY細胞分為對照組、miR-22 NC組、miR-22 mimics組、miR-22 mimics+740Y-P組進行實驗。當細胞生長融合至70%～80%時，參照LipofectamineTM2000試劑說明書給予miR-22 NC組、miR-22 mimics組、miR-22 mimics+740Y-P組細胞分別轉染miR-22 NC、miR-22 mimics、miR-22 mimics，對照組僅加入LipofectamineTM2000試劑，miR-22 mimics+740Y-P組細胞轉染miR-22 mimics 24 h后添加10 μmol/L的740Y-P 200 μL。各組轉染6 h后更換為正常培養基，繼續培養48 h后通過檢測對照組、miR-22 NC組、miR-22 mimics組細胞的miR-22表達情況評估轉染效率，然后進行后續實驗。

1.4.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力：轉染48 h后，收集各組細胞，消化、800 r/min離心5 min、重懸后計數，以3×103個/孔的濃度接種于96孔板中，置于5% CO2培養箱中37℃培養0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后加入CCK-8試劑，繼續放置于培養箱中孵育4 h，于酶標儀630 nm波長處讀取光密度值。實驗重復3次。

1.4.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力：轉染48 h后，收集各組細胞，將細胞消化、800 r/min離心5 min、重懸后，采用無血清的DMEM培養基稀釋細胞，按照2×104個/孔的濃度接種于已鋪有基質膠的上室，每孔200 μL，下室加入600 μL的DMEM完全培養基，置5% CO2培養箱中37℃繼續培養48 h后，取出上室，用甲醇固定20 min，棉簽擦掉上室殘余細胞，1%的結晶紫染色15 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗2遍，置于顯微鏡下觀察，選取4個高倍視野(400×)進行細胞計數，取平均值。實驗重復3次。

1.4.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況：轉染48 h后，收集各組細胞，胰酶消化使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，1 mL 結合緩沖液重懸，調整細胞密度為1×106個/mL，每管加入100 μL細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min，加入磷酸緩沖鹽溶液至500 μL，混勻后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測細胞PI3K/Akt信號通路蛋白磷酸化水平：轉染48 h后，收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取細胞蛋白，并采用二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，測定蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V、分離膠120 V電泳2 h，60 V轉膜2 h將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜后，將膜置于5%脫脂奶粉中室溫環境下封閉2 h，放入相應一抗(稀釋比例均為1∶2 000)于4℃孵育過夜，第2天用TBST清洗3次，10 min/次，加入二抗(稀釋比例為1∶1 000)于37℃孵育2 h，TBST清洗3次，滴加發光液，放入凝膠成像系統顯影。ImageJ軟件分析各個蛋白對應的灰度值，以GAPDH為內參照，計算蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4.7 裸鼠皮下移植瘤實驗：小鼠適應性飼養3 d后，按隨機數字表法分為對照組、miR-22 NC組、miR-22 mimics 組、miR-22 mimics+ 740Y-P組，每組5只。將1.4.2中轉染48 h后的對照組、miR-22 NC組、miR-22 mimics 組、miR-22 mimics+740Y-P組細胞(100 μL，1×107個/mL)注射至相應組別小鼠的右前肢皮下。待腫瘤組織生長至約100 mm3時，使用游標卡尺測量腫瘤體積，瘤體積(mm3)=0.5×長徑(mm)×短徑2(mm2)，每周測量1次，取第4周(第28天)時的測量結果進行分析。

1.5 統計學分析 應用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，GraphPad Prism 8.0作圖。計量資料以(x±s)表示，多樣本比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5種細胞中miR-22的表達水平 與正常人神經細胞RGC-5細胞比較，人髓母細胞瘤細胞系UW402、UW473、DAOY和ONS-76中miR-22細胞的相對表達水平均降低(均P<0.05)，其中DAOY細胞miR-22的相對表達水平最低(均P<0.05)，見表2。選擇miR-22相對表達水平最低的DAOY細胞為研究對象進行后續實驗。

表2 5種細胞的miR-22相對表達水平比較(x±s)

2.2 轉染效率的評估結果 與對照組比較，轉染miR-22 NC未改變DAOY細胞中miR-22的表達水平(P>0.05)，轉染miR-22 mimics后，DAOY細胞中miR-22的表達水平升高(P<0.01)，證明轉染成功。見表3。

表3 3組細胞的miR-22相對表達水平比較(x±s)

2.3 miR-22對DAOY細胞增殖能力的影響 轉染48 h后，繼續培養24～120 h，miR-22 NC組DAOY細胞的增殖能力與對照組差異無統計學意義(均P>0.05)，而miR-22 mimics組DAOY細胞增殖能力均低于對照組和miR-22 NC組(均P<0.05)，miR-22 mimics+740Y-P組DAOY細胞的增殖能力均高于miR-22 mimics組(均P<0.05)。見表4。

表4 4組細胞增殖能力的比較(x±s，吸光度值)

2.4 miR-22對DAOY細胞侵襲能力和凋亡情況的影響 與對照組比較，miR-22 NC組穿膜細胞數量和凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和miR-22 NC組比較，miR-22 mimics組的穿膜細胞數量減少，且凋亡率增加(P<0.05)；與miR-22 mimics組比較，miR-22 mimics+740Y-P組的穿膜細胞數量增加，且凋亡率降低(P<0.05)。見表5和圖1、圖2。

表5 4組細胞侵襲能力和凋亡率的比較(x±s)

圖1 4組DAOY細胞的侵襲能力(×400)

圖2 4組DAOY細胞凋亡情況

2.5 miR-22對DAOY細胞PI3K/Akt信號通路蛋白磷酸化水平的影響 與對照組比較，miR-22 NC組DAOY細胞PI3K和Akt磷酸化水平差異無統計學意義(均P>0.05)；與對照組和miR-22 NC組比較，miR-22 mimics 組PI3K和Akt磷酸化水平降低(均P<0.05)；與miR-22 mimics組比較，miR-22 mimics+740Y-P組細胞PI3K和Akt磷酸化水平升高(均P<0.05)。見表6和圖3。

表6 4組細胞DAOY細胞PI3K/Akt信號通路蛋白磷酸化水平的比較(x±s)

圖3 miR-22對DAOY細胞PI3K/Akt信號通路蛋白的表達及磷酸化水平的影響

2.6 miR-22對DAOY細胞皮下移植瘤的影響 與對照組比較，miR-22 NC組裸鼠皮下移植瘤體積差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和miR-22 NC組比較，miR-22 mimics組裸鼠皮下移植瘤體積減小(均P<0.05)；與miR-22 mimics組比較，miR-22 mimics+740Y-P組裸鼠皮下移植瘤體積增大(P<0.05)。見表7和圖4。

表7 4組裸鼠皮下移植瘤體積的比較(x±s，mm3)

圖4 4組裸鼠皮下移植瘤大小

3 討 論

髓母細胞瘤是最常見的兒童惡性腦腫瘤，其5年總生存率低至40%，盡管髓母細胞瘤的早期檢查和治療方法已有很大改進，但該病仍是導致兒童死亡的主要原因之一，且其轉移率和復發率均較高[9-10]。因此，尋找新的治療靶標對于髓母細胞瘤的臨床治療具有重要意義。

人類基因組中所包含的具有編碼蛋白質功能的基因約20 000個，僅占整個基因組的1.5%左右，其余的基因被稱為非編碼RNA[11]。非編碼RNA最初被認為是基因組的轉錄“噪音”，隨著研究的不斷深入，學者們逐漸發現無論是長鏈或是短鏈非編碼RNA，均對多種人類疾病具有調控作用[12]。研究證明，成熟的微小RNA可以通過3′-非翻譯區、5′-非翻譯區甚至mRNA編碼序列的不精確互補來調節靶基因的表達[13]。最近的研究表明，miR-22是哺乳動物中高度保守的微小RNA，在腫瘤發生和進展過程中發揮雙重作用，例如miR-22在白血病和前列腺癌中具有致癌作用，而在肺癌和結腸癌中發揮抑癌作用[14-15]。然而，目前miR-22在髓母細胞瘤中的作用尚未清楚。在本研究中，我們發現，與正常人神經細胞相比，髓母細胞瘤細胞系UW402、UW473、DAOY和ONS-76細胞中miR-22均呈低表達狀態，提示miR-22的低表達可能與髓母細胞瘤的發生過程有關。為了進一步研究miR-22低表達與髓母細胞瘤的關系，本研究以miR-22表達水平最低的DAOY細胞為研究對象，給予轉染miR-22后，采用CCK-8法、Transwell法和流式細胞儀分別檢測細胞的增殖活性、侵襲能力及凋亡情況。結果表明，上調miR-22的表達可抑制DAOY細胞的增殖、侵襲等生物學行為，并促進細胞凋亡，提示在髓母細胞瘤中miR-22可能發揮抑癌作用。

PI3K信號通路對于機體正常發育，以及包括癌癥在內的多種疾病的進展都具有重要作用，PI3K可通過與不同的結構域結合而被激活，Akt是PI3K下游關鍵蛋白之一，活化的p-PI3K可與Akt結合，促使Akt磷酸化活化，激活PI3K/Akt信號通路，進而影響腫瘤發生和發展過程[16]。例如，Duan等[17]研究發現，PI3K/Akt信號通路在結直腸癌細胞中處于活化狀態，該信號通路的激活可促進結腸癌的發生和發展；Wang等[18]的研究表明，抑制PI3K/Akt信號通路可抑制肺癌A549細胞的遷移、侵襲及上皮細胞-間充質轉化過程。研究表明，微小RNA可通過調節多種信號通路及基因表達參與惡性腫瘤的發生和發展[19]。因此我們進一步檢測各組細胞中PI3K和Akt磷酸化水平，探討miR-22的抑癌作用與PI3K/Akt信號通路的潛在關系。本研究結果顯示，上調miR-22的表達可降低PI3K和Akt磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信號通路激活，這提示miR-22改變DAOY細胞增殖、侵襲及促凋亡的作用可能與調節PI3K/Akt信號通路的表達有關。為了進一步驗證miR-22是否通過PI3K/Akt信號通路發揮作用，本研究使用PI3K激活劑740Y-P對細胞進行干預，結果顯示，740Y-P提高了PI3K和Akt磷酸化水平，激活PI3K/Akt信號通路，削弱了miR-22 mimics抑制細胞增殖、侵襲的作用，降低了細胞凋亡率。隨后，我們將轉染處理后的各組細胞移植于裸鼠皮下，觀察miR-22對DAOY細胞體內成瘤能力的影響，發現miR-22表達上調后，DAOY細胞移植瘤的體積小于對照組和miR-22 NC組，使用740Y-P處理細胞后，DAOY細胞移植瘤的體積大于miR-22 mimics組，與上述研究結果一致。這提示，miR-22可能通過PI3K/Akt信號通路影響DAOY細胞的體內及體外惡性生物學行為。

綜上所述，miR-22在髓母細胞瘤細胞系中表達下調，上調miR-22的表達可抑制DAOY細胞的增殖、侵襲并促進細胞凋亡，同時可抑制皮下移植瘤的生長，其作用機制可能與調節PI3K/Akt信號通路的表達有關，miR-22可作為髓母細胞瘤的潛在治療靶點。