過表達過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因對小鼠缺氧性腎損傷的影響▲

鄒家森 朱仕群 韋君雨 韋金雙 陳秀奇 覃遠漢

(廣西醫科大學第一附屬醫院兒科，南寧市 530021，電子郵箱：jianyeyu@outlook.com)

腎臟是對缺氧環境極度敏感的臟器，腎臟缺氧與急性腎損傷和慢性腎臟病都有著密切的聯系：急性缺氧可以導致急性腎損傷的發生[1]，急性腎損傷后腎臟的不完全性修復又會導致腎臟纖維化和慢性腎臟病[2-3]。轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是一種纖維化因子，能反映腎臟的纖維化程度，可作為評估慢性腎臟損傷的標志物[4-5]。研究顯示，腎臟的缺氧損傷可能與細胞壞死性凋亡有關[6-7]。壞死性凋亡是一種兼具壞死的形態學特征與可受多種基因調控雙重特點的細胞死亡形式，而混合譜系蛋白激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)是其關鍵執行因子[8]。由此可見，MLKL也與缺氧性腎損傷密切相關。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)屬于配體激活的核轉錄因子超家族，有α、β/δ、γ三種亞型，其中PPARγ與腎臟發育、代謝以及多種病理改變相關[9]。我們的前期研究發現，體外培養的腎小管上皮細胞經PPARγ激動劑羅格列酮干預后，可通過減少細胞的壞死性凋亡來減輕缺氧造成的損傷[10]。但在體內過表達PPARγ基因對缺氧性腎損傷的影響如何，尚無相關研究報告。為此，我們通過建立低壓低氧小鼠腎損傷模型，利用腺相關病毒載體過表達PPARγ基因，探討過表達PPARγ基因對小鼠缺氧性腎損傷的干預效果及作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 15只4周齡雄性C57BL/6小鼠，體重15～20 g，購買于長沙市天勤生物技術有限公司[許可證號：SCXK(湘)2019-0014]，飼養于廣西醫科大學實驗動物中心的無特定病原體動物飼養間，室溫20℃～25℃，濕度50%，明暗交替周期12 h，標準飼料喂養，自由進水、進食。本研究動物實驗操作均符合廣西醫科大學動物倫理委員會審查標準。

1.2 實驗分組與處理 按抽簽法將15只小鼠隨機分為對照組、缺氧組和過表達組，每組5只。適應性喂養1周后，以尾靜脈注射的方式給予過表達組小鼠單次注射過表達PPARγ基因的腺相關病毒200 μL，缺氧組和對照組注射等體積生理鹽水，實驗所用過表達PPARγ基因的腺相關病毒由和元生物技術(上海)股份有限公司設計和構建。注射3周后將缺氧組和過表達組小鼠置于低壓低氧動物實驗艙(上海塔望智能科技有限公司，型號：ProOx-810L)。參照Chhabra等[11]的研究設置條件，即模擬海拔高度為7 500 m(氧分壓約8 kPa)的環境，艙內設置充足飲水和食物，持續缺氧環境喂養7 d；對照組無特殊處理，常壓環境喂養7 d。7 d后即刻以5%水合氯醛按0.1 mL/10 g麻醉小鼠并取雙側腎臟，一部分置于4%多聚甲醛，用于制作病理切片、HE染色、過碘酸希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色、Masson染色以觀察病理學變化；另一部分置于-80℃冰箱中保存，用于蛋白質印跡實驗和實時熒光定量PCR實驗。取材完畢后頸椎脫臼處死小鼠。

1.3 腎組織病理學觀察 將多聚甲醛固定至少1 h的腎組織依次經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，制成石蠟切片。將石蠟切片分別按HE染色試劑盒(北京索萊寶公司、批號：G1120)、PAS染色液試劑盒(北京索萊寶公司、批號：G1281)、Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶公司、批號：G1340)染色并脫水封片，于光學顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織病理改變。

1.4 mRNA表達檢測 取各組小鼠腎臟組織磨碎，按RNA提取試劑盒(南京諾唯贊公司，批號：RC112-01)以離心柱法提取總RNA，以此為模板分別用引物擴增，引物序列物由生工生物工程(上海)有限公司設計并合成，序列見表1。按逆轉錄試劑盒說明書(南京諾唯贊公司，批號：R333-01)逆轉錄成cDNA，在ABI 7500型PCR儀上進行實時熒光定量PCR擴增，檢測熒光強度并計算相對表達量。PCR反應體系包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 2.0 μL、無酶水7.2 μL。反應程序：95℃預變性30 s；95℃、10 s，60℃、34 s循環40次；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s熔解曲線。采用2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

表1 基因引物序列

1.5 蛋白表達檢測 取各組小鼠腎組織磨碎，按十二烷基硫酸鈉蛋白裂解液說明書(上海碧云天公司，批號：P0013G)提取總蛋白，二喹琳甲酸法(賽默飛世爾公司，批號：23235)檢測蛋白濃度。添加上樣緩沖液并煮沸變性后行12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉法轉印至聚偏氟乙烯膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，放入分別含兔抗小鼠的PPARγ(Signalway Antibody公司，批號：49371)、MLKL(Abcam 公司、批號：ab184718)、TGF-β(Signalway Antibody公司，批號：48569)、β-肌動蛋白抗體(Signalway Antibody公司、批號：21800)4℃搖床過夜，一抗稀釋倍數均為1∶1 000，用TBST洗膜3次，10 min/次；再用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(Signalway Antibody公司，批號：L3012)常溫避光搖床孵育1 h，二抗稀釋倍數為1∶5 000，TBST洗膜3次，10 min/次。在FluorChem M成像系統上用增強化學發光法測定條帶灰度值，以β-肌動蛋白為內參并用AlphaView軟件分析計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組小鼠腎組織病理切片染色情況得比較 (1)HE染色顯示：與對照組比較，缺氧組小鼠腎組織中部分腎小管管腔變形、閉塞、堵塞，管腔內出現透明均染物質，腎小管細胞腫脹，部分顆粒變性；與缺氧組比較，過表達組小鼠腎組織病變程度較低，腎小管無明顯狹窄，部分腎小管細胞腫脹。(2)PAS染色顯示：與對照組比較，缺氧組小鼠腎組織中腎小管管腔內有壞死細胞碎片，部分腎小管管腔內基底膜消失；與缺氧組比較，過表達組腎小管管腔未見明顯碎片。(3)Masson染色顯示：與對照組比較，缺氧組小鼠腎間質有明顯纖維組織增生；與缺氧組比較，過表達組小鼠腎間質纖維增生不明顯。見圖1。

對照組HE染色 缺氧組HE染色 過表達組HE染色

2.2 3組小鼠腎組織PPARγ、MLKL、TGF-β mRNA相對表達量的比較 與對照組相比，缺氧組小鼠腎組織PPARγ mRNA相對表達量下降，MLKL、TGF-β mRNA相對表達量均升高(均P<0.05)；與缺氧組相比，過表達組小鼠腎組織PPARγ mRNA相對表達量升高，MLKL、TGFβ mRNA相對表達量均下降(均P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠腎組織PPARγ、MLKL、TGF-β mRNA相對表達量的比較(x±s)

2.3 3組小鼠腎組織PPARγ、MLKL、TGF-β蛋白相對表達量的比較 與對照組相比，缺氧組小鼠腎組織中PPARγ蛋白相對表達量下降，MLKL、TGF-β蛋白相對表達量升高(均P<0.05)；與缺氧組相比，過表達組小鼠腎組織PPARγ蛋白相對表達量升高，MLKL、TGF-β蛋白相對表達量均下降(均P<0.05)。見表3和圖2。

表3 3組小鼠腎組織中PPARγ、MLKL、TGF-β蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖2 蛋白電泳圖

3 討 論

由于自身解剖特點，腎臟極易發生缺氧性損傷[2]。腎臟的急性缺氧損傷主要是由腎灌注不足導致的，表現為腎小球濾過率驟然降低；急性腎損傷后毛細血管稀疏進一步加重了腎組織缺氧程度，缺氧又會進一步導致腎小管上皮損傷、成纖維細胞活化以及炎癥細胞的浸潤，從而導致腎小管間質纖維化[3,12]，這是急性腎損傷發展成為慢性腎臟病的標志[13]。本實驗中，我們利用低壓低氧動物實驗艙人為制造低氧環境，建立小鼠系統性缺氧模型，結果顯示缺氧組小鼠腎組織中腎小管狹窄閉塞、腎間質纖維化增生，腎臟損傷標志物TGF-β的表達明顯增高，這提示小鼠缺氧性腎損傷模型建立成功。

PPARγ的基本功能是調節脂肪和糖代謝[14-15]，但近年來越來越多的研究顯示PPARγ對缺氧缺血性腦損傷、動脈粥樣硬化、肺纖維化等疾病均有保護作用[16-18]。在腎臟疾病方面，PPARγ不僅可以通過上調解偶聯蛋白1的表達以抑制缺血再灌注或順鉑誘導的急性腎損傷[19]，還可以通過活化磷酸酶-張力蛋白同源物以抑制腎間質成纖維細胞活化而減輕腎纖維化[20]。我們的前期研究顯示，缺氧誘導的腎小管上皮細胞損傷模型中PPARγ表達明顯降低[21]。本研究中，缺氧組小鼠腎組織中的PPARγ mRNA與蛋白相對表達量均較對照組明顯降低(均P<0.05)。上述研究表明，PPARγ表達水平與腎損傷密切相關。因此，我們推測過表達PPARγ或許對缺氧性腎損傷具有干預作用。本研究結果顯示，過表達組小鼠腎小管狹窄閉塞程度明顯減輕，未見明顯的腎間質纖維化，且腎組織中的TGF-β表達明顯降低，這提示過表達PPARγ基因可減輕小鼠缺氧性腎損傷。

在腎臟缺氧損傷的過程中，細胞壞死性凋亡扮演了重要角色，Shen等[6]研究發現，壞死性凋亡特異性抑制劑Necrostatin-1可以使人腎皮質近曲小管上皮HK2細胞抵抗缺氧損傷，也可減輕大鼠缺血再灌注損傷。Liao等[7]研究發現，抑制壞死性凋亡可以減輕缺血再灌注后的急性腎損傷。我們的前期研究也發現，缺氧誘導的腎小管上皮細胞會高表達受體交互作用蛋白3等壞死性凋亡特異性標志物[10]。本研究中，缺氧組小鼠腎臟組織MLKL的mRNA與蛋白相對表達量較對照組均明顯增高，這提示缺氧性腎損傷可能是通過腎臟細胞壞死性凋亡所導致。而關于PPARγ的表達變化對壞死性凋亡的影響，不少學者對此進行了探討，Peng等[22]研究發現，PPARγ激動劑羅格列酮可降低心肌細胞壞死性凋亡，從而減輕盲腸結扎穿刺引起的敗血癥性心肌功能障礙；Huang等[23]研究報告，在低糖誘導的腦損傷中，PPARγ抑制劑可以通過抵抗二十二碳六烯酸的神經保護作用而增加神經細胞壞死性凋亡。本研究結果顯示，相比于缺氧組，過表達組小鼠腎組織PPARγ的mRNA與蛋白相對表達量升高，而MLKL的mRNA與蛋白相對表達量降低，這提示過表達PPARγ基因或可減少腎臟細胞壞死性凋亡，從而減輕小鼠的缺氧性腎損傷。

綜上所述，過表達PPARγ基因可減輕小鼠的缺氧性腎損傷，其機制可能與減少腎臟細胞壞死性凋亡有關。因此，PPARγ有望成為缺氧性腎損傷新的治療靶點。