基于PINK1/Parkin通路探討靈芝孢子對糖尿病腎病模型大鼠腎臟細胞凋亡的影響

周廣旭 齊亞靈 周少波 吳可佳 張瑩 石瑞平 秦麗微 王淑湘 付宏揚 張欣 王淑秋

(1佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2海南醫學院組織學與胚胎學教研室；3貝德福德大學生命科學學院生物與環境科學與技術研究所；4佳木斯大學附屬第一醫院)

糖尿病腎病(DN)是1型和2型糖尿病的一種由不受控制的高血糖長期累積腎單位進而損傷微血管的并發癥〔1〕，嚴重者可造成終末期腎衰竭，在DN發生發展過程中會出現腎小球肥大、系膜細胞增生、擴張、腎小管萎縮等病理改變〔1,2〕。自噬是細胞識別并分解自身異常成分、自我保護的過程。在自噬過程中，雙膜小泡會吞噬錯誤折疊、聚集的蛋白質和功能失調的細胞器，最終被溶酶體降解〔3〕。線粒體自噬可以抑制炎癥〔4〕，減少細胞死亡信號，防止細胞在遇到各種刺激后發生損害〔5〕。PTEN誘導假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)途徑通過調控自噬可及時識別并有效地清除異常線粒體，抑制氧化應激，維持細胞內環境穩態〔6〕。實驗證實，在高糖狀態下培養的足細胞，上調PINK1蛋白表達，可減少活性氧的生成，減輕足細胞損傷，使其功能蛋白正常表達〔7〕。

血糖的累積可損害腎小球內皮細胞，過度產生的活性氧導致氧化應激增強，進一步激活凋亡途徑〔8〕，導致廣泛功能障礙。靈芝在中國有千年藥用史，對機體健康具有有益功效,是一種藥食兩用的真菌〔9〕。靈芝孢子用途廣泛，目前已有研究表明，靈芝孢子通過改變巨噬細胞極性抑制肝癌細胞生長〔10〕。靈芝孢子具有明顯降血脂、降血糖、抗氧化等作用，研究表明，通過靈芝進行干預的糖尿病實驗，干預組大鼠血脂降低，高血糖癥改善，胰島素敏感增強性，糖耐量明顯改善〔11〕。目前尚無關于靈芝孢子對DN模型大鼠中PINK1/Parkin信號通路潛在的自噬和凋亡的影響的研究。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導DN模型大鼠為研究對象并給予靈芝孢子灌胃治療，通過生化指標試劑盒檢測大鼠血清中相關生化指標水平、腎臟病理及自噬與凋亡的相關指標，探討基于PINK1/Parkin通路靈芝多糖對DN模型大鼠腎臟結構和功能的主要影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 從哈爾濱醫科大學動物中心購進32只雄性SD大鼠〔實驗動物許可證號：SYXK(黑)2016-014〕，體重180～200 g。

1.2實驗試劑 STZ(Sigma公司)，PINK1、Parkin、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2均購自博士德生物工程有限公司，P62購自碧云天生物公司，微管相關蛋白1輕鏈(LC)3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3購自美國Abcam公司，激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-Caspase)3購自CST公司。尿蛋白定量測定法(CCB)尿蛋白試劑盒、血清肌酐檢測試劑盒及脲酶法尿素氮測試盒(批號均為：20201213，南京建成)、Masson染色試劑盒(貨號：20210320)、過碘酸希夫反應(PAS)染色液試劑盒(貨號：20210320)均購自北京索萊寶公司，靈芝孢子購自黑龍江省佳木斯市靈芝養殖場。

1.3DN模型制備和分組 32只SPF級雄性SD大鼠以躲避強光和噪聲，自由飲食和水喂養1 w。應用隨機數字表法分為正常對照(NC)組、高脂高糖(HF)組、DN模型(DN)組、靈芝孢子(GLSP)組各8只。HF組、DN組、GLSP組飼喂高脂高糖飼料(基礎飼料59%，白糖20%，豬油18%，蛋黃3%)28 d。禁食不禁水12 h后，DN組和GLSP組采用腹腔注射STZ(50 mg/kg)，NC組和HF組按相同環境、相同方法注射枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液(根據體重計算相應大鼠的注射量)。注射完畢后不立刻給予食物，2 h后直接飲用葡萄糖。3 d后，用眼科剪刀剪斷尾部末端取血檢測選擇血漿葡萄糖≥16.7 mol/L的大鼠。模型制備成功后，GLSP組每日灌胃給予靈芝孢子〔300 mg/(kg·d)〕，其余3組灌胃給予等量生理鹽水。每周固定時間測定空腹血糖。12 w后麻醉處死。

1.4取材與處理 待大鼠狀態穩定后，用無菌生理鹽水配制0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)溶液腹腔注射麻醉大鼠，分離出腎臟血管將其夾閉，從腹主動脈處進針采血 1 ml。取出腎臟組織并剝離腎臟被膜，一部分置于10%甲醛溶液固定24 h并標注分組，以用于蠟塊包埋進行病理學檢查及免疫組化分析。其余腎組織分成小塊分組分裝在EP管內并放在-80℃冰箱中保存，用于進一步Western印跡檢測相關蛋白。

1.5腎臟組織病理學檢測 將腎臟用10%甲醛溶液固定并包埋，分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色、PAS染色和Masson染色，用光學顯微鏡分別進行組織形態病理學觀察、系膜細胞及基底膜觀察、腎臟纖維化程度。

1.624 h尿蛋白、血清肌酐及尿素氮檢測 24 h尿蛋白檢測：將大鼠分批次置于金屬代謝籠中正常飲水并禁食1 d(注意大鼠糞便)，收集尿液并按照編號標識保存。充分混勻，靜置5 min，波長595 nm，雙蒸水調零，利用全自動酶標儀Synergy HT測定各管吸光度值。血清肌酐及尿素氮檢測：將裝有全血的分離膠試管在3 500 r/min條件，離心30 min后，EP管分裝血清，-80℃條件保存。分別用尿素氮試劑盒和肌酐測定試劑盒進行檢測。

1.7腎臟組織病理學檢測 將充分固定完成的腎臟進行石蠟包埋并切片，分別進行HE染色、PAS染色和Masson染色，用光學顯微鏡分別進行組織形態病理學觀察、系膜細胞及基底膜觀察、腎臟纖維化程度。

1.8免疫組化檢測 60℃恒溫箱烤片15 min，新鮮二甲苯2次脫蠟，放置100%、95%、90%、85%、80%、75%乙醇脫水，枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.2)熱修復抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)振蕩沖洗，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液37℃水浴箱孵育，滴加適當比例稀釋的一抗4℃冰箱過夜，PBS洗滌，滴加生物素化的抗兔或抗鼠二抗放置濕盒37℃孵育，滴加鏈霉親和素生物復合物(SABC)放置濕盒37℃孵育，二氨基聯苯胺(DAB)顯色1～5 min，蘇木素輕度復染并藍化1～2 h，脫水至透明，中性樹膠封片烘干，光學顯微鏡進行圖像采集，并對陽性面積進行分析。

1.9TUNEL檢測法觀察腎臟組織凋亡細胞分布及凋亡率情況 60℃恒溫箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.2)熱修復，50 μl 3%H2O2室溫避光靜置，50 μl TUNEL反應緩沖液(此步驟之后直至熒光觀察前的所有實驗步驟需避光進行)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染細胞核，抗熒光淬滅劑封片。制成的片子應立即觀察，或避光保存于-20℃，1 w之內進行觀察。陽性細胞核呈綠色熒光。

1.10Western印跡檢測 RIPA裂解液研磨腎臟組織，離心取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度，置膠，根據蛋白濃度調整上樣量，電泳：恒壓80 V，marker跑出紅線轉恒壓120 V，溴酚藍即將跑出膠板，轉膜：恒電流260 mA，30 min，封閉：5 % 脫脂奶粉37℃孵育，一抗4℃過夜，洗膜孵育TBST稀釋HRP 標記的二抗，用BeyoECL Plus發光液在DM4000B圖像信號采集分析系統中檢測信號強度大小，再用Image J1.8軟件分析條帶光密度值，并與GAPDH內參吸光度的比值進行相對表達量的計算。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠一般狀態比較 與造模前比較，DN組大鼠體重減輕，嗜睡而且反應遲緩，飲食增加，毛發雜亂不柔順，小便異常頻繁，墊料的濕度在同一時間內相比其他組要更嚴重。而GLSP組大鼠，精神比較活躍，對外界刺激有明顯的躲避行為，但毛發無明顯變化。

2.2各組空腹血糖、血清尿素氮、血肌酐及24 h尿蛋白水平比較 與NC組相比，DN組空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及尿素氮水平明顯增多(P<0.01)，而HF組空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及尿素氮水平無明顯變化(P>0.05)；與DN組與HF組相比，GLSP組空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及尿素氮水平明顯降低(均P<0.01)，見表1。

2.3各組腎臟組織病理學觀察 HE染色觀察大鼠腎臟形態病理學改變：NC組與HF組腎單位輪廓清晰，形態正常。在DN組中，腎小體直徑增大，且部分腎小球內出現中性粒細胞及單核細胞，部分腎小囊消失，腎小管內出現蛋白管型，管壁變厚并伴水腫。經靈芝孢子干預，GLSP組腎小球內炎性細胞減少，腎小球直徑減小，腎小管管壁均有改善。PAS染色觀察大鼠腎臟形態病理學改變：DN組病理改變主要表現為腎小球體積增大，腎小球內有深淺不一紅色淡染的陽性物質沉積，腎小球基底膜均質性增厚，系膜細胞增生，腎小囊基底膜明顯增厚。與DN組相比，GLSP組腎小球中見少許紅色淡染的陽性物質沉積，病變程度均減輕。NC組及HF組腎單位基本正常，未見明顯的紅色淡染的糖原沉積。Masson染色觀察腎臟纖維化改變：DN組的腎小球內膠原纖維明顯增加(膠原纖維呈藍色)，GLSP組腎臟組織呈部分藍染膠原纖維沉積，NC組呈紅染狀態，HF組呈部分藍染膠原纖維沉積。見圖1。

圖1 靈芝孢子對腎臟組織病理變化及形態學的影響(×400)

2.4各組免疫組化檢測結果 DN組相比NC組腎臟P62、Bax蛋白陽性著色覆蓋面積增多，蛋白表達升高，Bcl-2蛋白陽性著色覆蓋面積減少，蛋白表達降低，HF組腎臟P62、Bax蛋白陽性著色覆蓋面積增多，蛋白表達模式表現出較強的反應性，Bcl-2蛋白陽性著色覆蓋面積減少，這種反應性明顯降低；與DN組相比，GLSP組腎臟P62蛋白陽性著色覆蓋面積減少，表達降低、Bax蛋白表達明顯降低，陽性著色覆蓋面積減少，Bcl-2蛋白陽性著色覆蓋面積增多，表達模式表現出較強的反應性。見圖2。

圖2 各組腎臟中P62、Bax、Bcl-2蛋白表達(免疫組化，×400)

2.5各組腎臟細胞凋亡水平 NC組、HF組、DN組及GLSP組細胞凋亡率依次為(1.88±0.18)%、(6.77±0.45)%、(7.52±0.24)%、(4.06±0.31)%。NC組熒光強度較弱，腎臟細胞多數保持正常，有極少數細胞發生凋亡；與NC組相比，DN組中熒光強度增強，HF組中凋亡細胞明顯增加(P<0.01)；與DN組相比，GLSP組中細胞熒光強度明顯下降(P<0.01)。見圖3。

圖3 TUNEL檢查法觀察各組腎臟細胞凋亡情況(×400)

2.6Western印跡法檢測各組自噬蛋白表達 與NC組相比，DN組腎臟PINK1、Parkin蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低，而P62蛋白表達顯著升高(均P<0.01)；與DN組相比，GLSP組腎臟PINK1、Parkin蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，而P62蛋白表達顯著降低(均P<0.01)。見表2、圖4。

圖4 各組腎臟中PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達

2.7靈芝孢子預防DN大鼠的腎臟細胞凋亡 與NC組相比，DN組腎臟Bcl-2/Bax比值顯著下調，Caspase3、Cleaved-Caspase3表達水平明顯升高(P<0.01)。與DN組相比，GLSP組腎臟Bcl-2/Bax比值明顯升高，Caspase3、Cleaved-Caspase3表達水平明顯降低(P<0.01)。見表2、圖5。

圖5 各組腎臟Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表達

3 討 論

本研究使用高脂高糖飲食聯合腹腔注射STZ誘導大鼠制備T2DM模型〔12～15〕，發現單純給予高脂高糖飼養的大鼠與正常飼料飼養的大鼠相比，血糖無明顯變化，體重有略微增加，但相關蛋白有所改變，說明高脂高糖的不良飲食習慣會造成相關組織的損傷。通過分析大鼠腎臟細胞的損傷過程發現，受損的足細胞引起腎臟濾過大量的蛋白進而引發相關疾病〔15〕。本研究發現DN組大鼠尿液中出現大量的尿蛋白。

正常情況下，正常細胞受到任何刺激都可影響自噬的發生。當沒有刺激時，機體由于衰老、細胞結構的丟棄、能量的回收等原因，自噬水平會有輕微的波動。正常細胞可通過線粒體自噬調節自身穩態。當細胞受到各種因素刺激時，通過PINK1/Parkin通路識別異常的線粒體并與溶酶體結合最終被水解酶降解。實驗證實，高糖培養的足細胞活性氧顯著增加造成線粒體損傷，上調PINK1后活性氧顯著下降，通過調控自噬進一步清除受損的線粒體〔7〕。

PINK1是清除受損線粒體過程中所必需的蛋白，并進一步激活Parkin蛋白。本研究結果表明給予靈芝孢子治療可激活DN模型大鼠腎臟細胞中保護性自噬。

線粒體損傷是引起細胞功能異常進而造成細胞死亡的主要原因〔16〕，過度產生的活性氧導致氧化應激，三磷酸腺苷(ATP)產生受到阻礙，細胞出現不可逆的損傷〔17,18〕。凋亡是細胞自發的、有規律的,是為了清除功能異常的細胞而維持穩態。當抑制正常細胞凋亡時，會引起癌癥或相關疾病的產生，而激活細胞凋亡則會導致神經退行性病變及加重腎缺血再灌注損傷〔19,20〕。細胞凋亡時會伴隨Bax結合線粒體復合物，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和其他抗凋亡蛋白能夠有效抑制線粒體上的促凋亡蛋白(tBid)/Bax或Bax/Bax復合體形成〔21〕。

本研究結果表明，隨著給予靈芝孢子治療，不僅可以改善大鼠腎功相關生化水平，而且血糖水平也得到了改善，靈芝孢子可能通過PINK1/Parkin通路，調節線粒體自噬，抑制重要的促凋亡蛋白表達，改善高血糖癥，腎臟功能得以保障。但其具體的調節機制尚未明確，可進一步研究靈芝孢子對于氧化應激、線粒體動力相關蛋白及炎癥等方向的關注。

綜上，靈芝孢子可能基于PINK1/Parkin通路，改善高血糖癥，減輕腎臟纖維化，通過激活腎臟細胞的保護性自噬，進而抑制腎臟細胞凋亡，提高腎臟濾過能力，改善腎臟細胞損害從而保護腎臟。