MTSS1及Gli1在食管鱗癌組織中表達及其相關性

何章彪 王翠俠 韓文杰 趙琳 陳奎生

(1商丘醫學高等專科學校五官科，河南 商丘 476100；2商丘市第一人民醫院腫瘤科；3鄭州大學第一附屬醫院病理科)

腫瘤轉移抑制基因(MTSS)1是由Lee等〔1〕通過改良的mRNA差異顯示技術在研究膀胱癌轉移機制過程中發現的一個新基因,該基因定位于人類染色體8q24.1區域,是一個轉移抑制候選基因，編碼5.3 kb的轉錄產物。膠質瘤相關癌基因蛋白(Gli)1是局域性蛋白質配體(Hh)信號通路的下游轉錄調控因子之一，其表達水平增高標志著Hedgehog信號轉導通路處于激活狀態，在正常情況中對Hh信號通路起正調控作用〔2〕。有關食管鱗癌組織中MTSS1和 Gli1蛋白表達及其意義尚未見文獻報道。本文采用免疫組化和原位雜交法觀察食管鱗癌組織中MTSS1和Gli1蛋白表達，探討其與食管癌發生發展的關系及MTSS1和Gli1的相關性。

1 資料與方法

1.1實驗標本 標本選取商丘市第一人民醫院2018年6月至2019年12月經病理證實的手術切除新鮮食管鱗狀上皮細胞癌標本，共計136例，男88例，女48例，年齡48～81歲，平均(64±5.1)歲，患者的臨床及病理資料完整，術前均未進行化放療和免疫治療。患者簽訂知情同意書后進行病理取材，所取標本分別為遠端正常黏膜組織、癌旁3 cm內組織、無壞死癌灶處組織，癌灶區標本病理證實為食管鱗狀上皮細胞癌。136例癌旁組織中經蘇木素-伊紅(HE)染色發現有96例為中-重度不典型增生組織。按有無淋巴結轉移分為：轉移組74例和無轉移組62例。所有標本取材后放入10%多聚甲醛固定(在固定液中加入0.1%二乙基焦碳酸酯以抑制RNA酶的活性)，病理標本經常規脫水、石蠟包埋后4 μm厚連續切片。對食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜分別進行HE染色、免疫組化和原位雜交染色。

1.2實驗試劑 MTSS1抗體為鼠單克隆抗體，購自美國Abcam公司(ab56780)，工作濃度1∶130 稀釋；Gli1抗體為兔單克隆抗體，購自美國Abcam公司 (ab49314)，工作濃度1∶200稀釋，多聚體分子(Envision)免疫組化試劑盒(二K5007DAB顯色系統)購自北京中杉金橋生物技術開發有限公司；胃蛋白酶、預雜交液及核固紅均購自武漢博士德生物工程有限公司；堿性磷酸酯酶標記(SP-AP)及堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(BCIP/NBT)購自美國Promega公司，MTSS1探針(5′-GGTCCACTGAGCCCCACACATTGTT-3′)，Gli1探針(5′-AGGAGCGGCGGCTGACAGTATAGGC-3′) 由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.3方法

1.3.1標本處理 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織經40 g/L的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化及原位雜交檢測。

1.3.2免疫組織化學 免疫組化SP法染色步驟按照試劑盒及一抗(濃度為1∶100)說明書要求進行，同時用購自美國Abcam公司(MTSS1和Gli1)的陽性對照片進行陽性對照及用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3.3原位雜交 參照原位雜交試劑盒說明書操作，以不含探針的預雜交液進行雜交及雜交前用核糖核酸酶(RNase)處理樣本作陰性對照〔3,4〕。

1.3.4免疫組化和原位雜交結果判定 在高倍鏡視野下對目標區域連續計數200個細胞，計算陽性細胞數占全細胞數的百分比評分。陽性細胞所占比例<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色深淺評分：樣本無染色為0分；樣本弱染色為1分；樣本中等染色為2分；樣本強染色為3分。將樣本兩者得分相乘記為總分。根據分數把樣本界定為4類：0～1為陰性(-)，2～4為陽性(+)，5～8為中陽性()，9～12為強陽性()〔3,4〕。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Spearman秩相關分析。

2 結 果

2.1免疫組化與原位雜交結果 MTSS1主要存在于細胞的細胞核/細胞質中，染色呈淡黃至棕黃色。MTSS1 mRNA陽性表達主要存在于細胞核/細胞質中，呈棕紫色顆粒。Gli1主要存在于細胞的細胞質中，染色呈淡黃至棕黃色。Gli1 mRNA陽性表達主要存在于細胞質中，呈棕紫色顆粒。見圖1。

2.2食管鱗癌組織中MTSS1、Gli1的蛋白及mRNA表達 見表1。MTSS1蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中呈低表達，在癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中呈高表達；Gli1蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中呈高表達，在癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中呈低表達，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

圖1 食管鱗癌組織中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA的表達(SP,×400)

表1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及其正常組織中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA表達比較〔n(%)〕

2.3MTSS1及Gli1蛋白表達與食管癌轉移的關系 見表2、表3。有淋巴結轉移的食管鱗癌組織中MTSS1蛋白〔12例(16.2%)〕及mRNA表達〔6例(8.1%)〕均明顯低于無淋巴結轉移的相應組織〔28例(45.2%)、45例(72.6%)〕，Gli1蛋白〔68例(91.9%)vs 47例(75.8%)〕及mRNA表達〔64例(86.5%)vs 21例(34.0%)〕均明顯高于無淋巴結轉移的相應組織(均P<0.05)。

2.4MTSS1和Gli1的相關性分析 食管鱗癌組織中MTSS1蛋白與Gli1蛋白表達呈負相關(r=-0.422，P<0.001)。見表2。食管鱗癌組織中MTSS1 mRNA與Gli1 mRNA表達呈負相關(r=-0.389，P<0.001)。見表3。

表2 食管鱗狀細胞癌組織中MTSS1與Gli1蛋白的表達情況(n)

表3 食管鱗狀細胞癌組織中MTSS1與Gli1 mRNA的表達情況(n)

3 討 論

3.1Hedgehog信號通路與食管鱗癌的關系 Hedgehog信號轉導通路在進化上高度保守并有重要生物學功能。胞膜上的受體 Patched(Ptch1、Ptch2)、胞外配體Hh及跨膜蛋白(Smo)和細胞內部的下游轉錄因子鋅指核轉錄因子Gli蛋白等組成了Hedgehog信號轉導通路〔2〕。Hedgehog通路調控胚胎發育過程中的細胞分化和增殖。Hedgehog信號通路與腫瘤的發生發展有著密切聯系，有關文獻報道包括：前列腺癌、皮膚基底細胞癌、胃癌、白血病、小細胞肺癌等惡性腫瘤，在這些報道中提到了發現該通路存在異常的激活。在Hh通路上任何成員的突變或缺失都可能導致信號傳遞的改變〔3〕。目前已有文獻報道該信號通路的異常激活與食管鱗狀細胞癌的發生有著密切的聯系〔4〕。信號傳導分子Gli在Hh信號通路中起到重要作用，Hh通路末端的轉錄激活因子Gli1蛋白在Hh相關性腫瘤的發生、發展過程中起著必不可少的作用〔5〕。因此Gli 的表達水平可以作為反映 Hh信號通路活性的一個可靠指標，Gli1表達異常可以通過多種途徑誘導腫瘤的發生、發展以及侵襲性生長。

本研究發現在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織、正常食管黏膜中Gli1的蛋白的表達依次降低，這表明Hh信號通路與食管鱗癌的發生關系密切，Hh信號通路在食管鱗癌中活化這一觀點得到了支持。通過Gli1蛋白的表達結果和臨床病例資料對比分析顯示，與腫瘤的浸潤程度和有無淋巴結轉移相關，這提示Hh信號通路有可能參與了食管鱗癌的侵襲性生長，可通對Hh信號通路調控來抑制腫瘤的生長。

3.2MTSS1與食管鱗癌的關系 目前對于MTSS1的作用和功能還存在一定的爭議。早期研究〔6〕發現MTSS1在未轉移的膀胱癌細胞中高表達，在高轉移的膀胱癌細胞株中低表達，這提示在腫瘤侵襲和轉移的過程中MTSS1有可能是一個有抑制能力的蛋白。MISS1可能作用于肌動蛋白細胞骨架，從而抑制癌細胞轉移。但是有學者認為MISS1的低表達和腫瘤的侵襲性轉移相關性有待進一步研究，MTSS1并非都是作為一個轉移抑制因子存在，如Yao等〔7〕研究發現肝癌組織中MTSS1 mRNA及蛋白上調，且MTSSl是肝癌早期病變的誘導者,寇煒等〔8〕研究發現MISS1在膀胱癌中表達下降，但與膀胱癌的侵襲行為無關。張曙光等〔9〕采用免疫組化和RT-PCR等方法研究發現MTSS1在食管鱗癌組織和細胞低表達，這與本研究結果相一致。本研究提示MTSS1在食管鱗癌的侵襲性生長過程中可能作為一個抑制信號，但是其具體發揮的作用尚有待進一步研究。

3.3MTSS1在Hedgehog信號通路中的作用 MTSS1自從發現以來，多數學者認為其作為一種細胞骨架蛋白，其表達受到信號肽(Shh)的調控〔10〕。Shh作為Hh信號通路中的一種重要的信號肽，在哺乳動物中廣泛表達，控制著不同類型祖細胞的比表達。Shh可以通過下游Gli信號分子控制細胞的生長、增值和分化，同時也參與了腫瘤細胞的增殖和擴散〔11〕。作為Shh通路上的相關基因MTSS1能夠協同Gli轉錄從而激活Shh途徑的轉錄〔12〕。在眾多Gli的啟動基因中，在多種組織系統中MTSS1可以促使其轉錄。MTSS1、Gli1/Gli2及Gli相關蛋白細胞內調控組分(Sufu)三者合成三元絡合物，Gli介導的轉錄受到促進，進一步促進了成瘤和瘤體生長過程及腫瘤細胞增殖與侵襲〔13〕。所以MTSS1可能是Shh的一個靶基因，通過Shh途徑參與腫瘤的發生發展。目前有關Hedgehog信號通路的研究，以該通路對腫瘤發生及瘤體生長的作用居多，但最近有關肝癌、卵巢癌、胰腺癌的研究中發現，過度活化的通路也會促進腫瘤的侵襲性生長和轉移〔14〕。但MTSS1在該通路中如何促進腫瘤的生長、侵襲和轉移的機制尚不明確。

本研究將食管鱗癌組織中MTSS1的表達和Hedgehog信號通路中重要的信號分子Gli1的表達對比分析顯示，其蛋白表達呈現負相關。但在食管鱗癌的發生遷移過程中，MTSS1是否參與Hedgehog信號的表達調控及Hedgehog信號通路是否參與了食管鱗癌的侵襲性生長和遷移尚不甚明了。在食管鱗癌中，MTSS1的表達調控有可能和Hedgehog信號通路中的某些分子存在相互抑制作用，也有可能MTSS1只是在一定階段或一定濃度下對 Hedgehog信號通路其調控作用，這些問題都有待于進一步討論研究。