蛋白磷酸酶4在缺血性腦卒中大鼠肝、腦組織中的差異表達

田美媛 侯靜 黃登亮 張耀剛 江源 孫莉 張濤 李志琴 童思賢 馬艷艷,2

(青海大學 1附屬醫(yī)院中心實驗室，青海 西寧 810000；2醫(yī)學院；3附屬醫(yī)院科研管理部)

缺血性腦卒中急性期可出現(xiàn)多臟器功能損傷，嚴重時可引發(fā)多器官功能衰竭而增加致殘率和死亡率〔1〕。腦損傷和肝臟應激性損傷是常見的受累臟器，并被認為是全身應激性炎癥反應的始動和擴大器官〔2～4〕。因此，積極探索腦卒中的發(fā)病機制，降低腦卒中的發(fā)病率是當前醫(yī)學研究的重點和前沿。研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者機體細胞可表現(xiàn)為能量代謝障礙、細胞內鈣離子超載、活性氧(ROS)的生成、氧化應激及細胞凋亡等〔5〕。能量代謝中的關鍵蛋白表現(xiàn)出對缺血性神經(jīng)重要的保護作用，雖然它們的機制還不甚明確，需要進一步探索。蛋白磷酸酶(PP)4是PP2A家族的重要成員之一，是調節(jié)糖和脂質代謝的新因子〔6〕；PP4基因也被證明參與了許多重要的細胞過程的調控〔7〕；作為位于中心體的蛋白，PP4參與中心體的成熟和微管的生長〔8〕；PP4還通過去磷酸化復制蛋白(RP)A2和組蛋白家族成員(H2A)X參與DNA損傷修復〔9,10〕。

然而，考慮到缺血性腦卒中能量代謝的關系，很少有研究探討PP4在缺血性腦卒中最常受影響的肝和腦組織中的作用。本研究通過線栓法建立大鼠缺血性腦卒中模型，進一步探討在缺血性腦卒中大鼠模型中肝組織和腦組織中PP4的表達水平，為PP4參與缺血性腦卒中提供線索。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1動物分組 45只健康雄性SD大鼠(體重：250～280 g),購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場(許可證號：3201111979),隨機將SD大鼠分為正常(NORMAL)組、假手術(SHAM)組、大腦中動脈阻塞(MCAO)組，每組15只，MCAO組再分為MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組3個亞組，每個亞組5只。

1.1.2主要儀器和試劑 OLYMPUS立體顯微鏡，熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ)，數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司，編號：0004)，超微量核酸蛋白濃度測定儀(Nanodrop2000C)，全景組織定量分析系統(tǒng)(TG：ZEISS Axio Imager Z2)，化學發(fā)光凝膠成像儀(AI600QC)，SYBR Green(Roche)，Trizol(TaKaRa)，蛋白酶抑制劑PMSF(BOSTER)，RNA反轉錄試劑盒(TransGen)，PP4調節(jié)亞基(PP4R)2抗體(ab70631)和PPX抗體(ab16475)購自Abcam，PP4催化亞基(PP4C)和內參β-actin引物(上海生工有限公司合成)，線栓(購于北京西農科技有限公司，型號：2436-A5)

1.2實驗方法

1.2.1大鼠造模 術前1 d禁食不禁水，用Nagasawa等〔11〕的改良線栓法制成MCAO模型，用5%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,仰臥固定；在顯微鏡下分離右側頸總動脈、迷走神經(jīng)、頸內動脈，結扎頸總動脈，在頸總動脈處掛線；用動脈夾夾閉頸內動脈遠心端后,距動脈分叉4 mm剪一斜行切口,將線栓由頸總動脈插入頸內動脈,取下動脈夾，插入深度(18.5±0.5)mm,稍遇阻力感即停；固定線栓，剪斷栓尾，縫合皮膚，碘伏消毒，術中及術后注意保暖。SHAM組只分離血管和神經(jīng)。

1.2.2神經(jīng)功能損傷評分 參考Longa等〔12〕的4級評分法在大鼠清醒后進行神經(jīng)功能損傷評分。0分:無神經(jīng)損傷癥狀；1分:不能伸展對側前爪；2分：向一側轉圈追尾；3分:向對側傾倒；4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。1～3分納入研究，0分和4分予以排除。

1.2.3切片制作及尼氏染色方法 各組大鼠在預定時間點麻醉處死,迅速斷頭取腦,在-20℃冷凍30 min,置腦模具中由額極到枕極切成2 mm厚的冠狀切片,放于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫蠟水化后將切片浸入1%甲苯胺藍溶液染色6 min，蒸餾水浸5 min去除浮色，依次放入70%乙醇2 min，95% 乙醇5 min，100%乙醇浸泡 3 min；然后用透明劑(二甲苯)透明2次，5 min/次，中性樹膠封片。每只大鼠隨機選擇2張經(jīng)尼氏染色的大腦切片進行觀察。將切片置于20倍全景組織定量分析系統(tǒng)顯微鏡下觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞尼氏小體的染色情況，觀察其病理改變。

1.2.4各組大鼠腦組織及肝組織中PP4 mRNA水平檢測 取各組-80℃保存的大鼠腦組織和肝組織標本約0.2 g，液氮快速研磨，并根據(jù)Trizol法提組織RNA；測濃度及純度，取1.5 μg總RNA反轉錄成cDNA；將逆轉錄產(chǎn)物稀釋5倍，取2 μl作為模板進行qPCR。PP4C上游引物：5′-TGGCTGACTATTTCCTGTGAC-3′，下游引物：5′-CAACCTCTCCAGAGCAAGTC-3′，內參β-actin上游引物:5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游引物:5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。以滅菌純水為無模板對照，使用不經(jīng)逆轉錄的總RNA作為模板檢測基因組DNA污染。qPCR 數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法,利用Graph pad8.0作圖。

1.2.5各組大鼠腦組織及肝組織中PP4 蛋白水平檢測 取100 mg -80℃保存的腦組織，液氮充分研磨后加入0.5 ml RIPA(含PMSF)充分裂解組織提取蛋白，用Bradford法測濃度。各組取相同量總蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脫脂牛奶的PBST溶液封閉 PVDF 膜，山羊抗小鼠PP4抗體(1∶1 000)與封閉的PVDF膜室溫孵2 h，PBST 洗膜，二抗(1∶5 000) 室溫孵育PVDF膜2 h，PBST洗膜，最后采用電化學發(fā)光(ECL)法進行顯色。利用圖像處理軟件Image J對蛋白電泳圖進行灰度分析，并以目的蛋白和內參蛋白的比值作為目的蛋白的相對定量值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評分分析 MCAO組〔MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組神經(jīng)功能損傷評分分別為：(1.145±0.363 6)分、(2.170±0.574 5)分、(2.950±0.463 0)分〕動物出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀,主要表現(xiàn)為活動減少、精神萎靡、行走時向左側傾倒或是不停地轉圈追尾，MCAO-6 h組、MCAO-12 h組神經(jīng)功能損傷評分顯著高于MCAO-2 h組(P<0.01，n=5)。NORMAL組及SHAM組動物肢體活動自如,無神經(jīng)功能損傷癥狀。

2.2各組腦組織形態(tài)學分析 尼氏染色顯示,NORMAL組及SHAM組神經(jīng)細胞未見明顯異常，MCAO組梗死區(qū)尼氏小體數(shù)量減少，隨時間延長，尼氏小體數(shù)量遞減，見圖1。

圖1 各組腦組織尼氏染色(×20)

2.3肝、腦組織中PP4 mRNA水平分析 MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組腦組織PP4C mRNA水平較NORMAL組顯著降低(P<0.05,P<0.001)；MCAO-2 h組肝組織PP4C mRNA水平較NORMAL組顯著升高(P<0.001)；MCAO-6 h組、MCAO-12 h組肝組織PP4C mRNA水平與NORMAL組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4腦卒中肝、腦組織中PP4蛋白的表達 MCAO-2 h、MCAO-6 h組腦肝組織PP4R2蛋白水平較NORMAL組顯著降低(P<0.001,P<0.01)；MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組肝組織PP4R2蛋白水平較NORMAL組顯著升高(P<0.01)；除MCAO-12 h組肝組織PPX蛋白水平較NORMAL組顯著降低(P<0.01)外，各組腦組織、肝組織PPX蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

1～4：NORMAL組、MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組圖2 PP4R2和 PPX蛋白在大鼠腦、肝組織中的表達

3 討 論

缺血性腦卒中與其他缺血性疾病類似，其發(fā)病過程是一個多步驟、多途徑、多階段相互作用和相互影響的復雜過程，這是導致該病治療困難，致殘率高、復發(fā)率高的重要原因〔13〕。研究表明，其致病機制極為復雜，腦缺血過程中，能量代謝障礙是腦缺血損傷的首要環(huán)節(jié)，而炎癥和氧化應激損傷在腦缺血損傷過程中也扮演著重要的角色〔14,15〕。因此，從分子水平揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機制，成為該病治療的研究熱點。

本研究從分子水平驗證PP4在缺血性腦卒中腦、肝組織的表達是否存在差異。因為腦缺血損傷是一個復雜的病理級聯(lián)反應，包括能量代謝紊亂、氧化應激、血腦屏障、炎癥反應及炎癥反應引起的細胞因黏附分子表達增加促進的炎癥細胞浸潤〔16〕。DNA雙鏈斷裂修復過程中會產(chǎn)生Ser-140位點磷酸化的H2AFX蛋白(γ-H2AFX)，而PP4C-PP4R2-PP4R3A PP4復合物可特異性使該位點脫磷酸，這是DNA修復的重要步驟。 研究表明，PP4作用的增加主要歸因于PP4R2的增加，該亞基增強了磷酸IKKα/βS176/180與PP4C的締合，導致磷酸化 IKKα/βS176/180〔17〕。本研究結果表明缺血性腦卒中大鼠機體內PP4 處于低表達狀態(tài)，因為體內能量代謝紊亂和供能降低在多種神經(jīng)病理性損傷中起重要作用，能量供應在有效治療缺血性疾病中至關重要〔18〕。缺血性腦卒中導致腦部缺血缺氧，進而引起能量代謝降低，而腦部屬于缺血性腦卒中直接影響部位，并且腦是機體中耗能最高的器官。本研究中MCAO-2 h組肝組織PP4C mRNA表達水平較NORMAL組高，6 h和12 h與NORMAL組無差異，可能與腦卒中患者血脂異常發(fā)生率較高，且總膽固醇增高明顯有關〔19〕。隨著總膽固醇增高，脂代謝增強，而肝臟是脂代謝的主要器官，因而在肝組織PP4表達增強；而6 h和12 h mRNA表達水平可能是隨時間延長，肝臟通過代償使PP4表達與NORMAL組一致〔20〕。肝組織蛋白水平和基因水平在6 h和12 h稍存在差異，可能是當機體發(fā)生急性缺血性腦卒中時，肝細胞缺血缺氧狀態(tài)刺激機體快速將PP4C mRNA水平翻譯成蛋白，短時間內提高了PP4C基因的翻譯效率，但機體PP4C基因瞬時轉錄水平有限，不足以修復肝損傷區(qū)和缺血區(qū)肝細胞內大量已損傷DNA分子，尚無法逆轉急性缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展〔21〕。

綜上所述，在缺血性腦卒中發(fā)病前后的肝、腦組織中PP4的表達差異明顯，而腦組織和肝臟呈現(xiàn)不同的表達變化模式，提示PP4與缺血性腦卒中存在一定關聯(lián)性，并且腦卒中過程中PP4在腦組織和肝臟中的功能因組織種類而可能具有差異，為今后對缺血性腦卒中靶向用藥和進一步研究提供了思路和方向。