地氟烷對老年大鼠海馬Aβ、Tau蛋白表達及學習記憶能力的影響

龔濤武 趙鵬程 吳振宇 楊洋 朱宇航 張超 朱昭瓊

(1遵義醫科大學附屬醫院麻醉科，貴州 遵義 563000；2貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室;3遵義醫科大學麻醉醫學院)

地氟烷作為一種新型鹵代吸入麻醉劑，具有起效快、蘇醒迅速和可控性強的特點，在臨床上得到廣泛應用〔1〕。目前，我國接受手術的老年患者日趨增多，鑒于地氟烷的藥理特點，其在老年患者的麻醉使用具有明顯的優勢，但有關地氟烷在老年患者中應用是否會造成患者術后發生記憶能力的損害報道較少。因此，本研究擬借助動物行為學實驗及相關蛋白的研究，評價地氟烷對老年大鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 地氟烷(批號：H094F622)；無水乙醇(無錫展望)；磷酸鹽緩沖液(PBS，無錫菩禾)；5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(無錫菩禾)；抗原修復液(Beyotime)；Hochest染色(Beyotime)；Morris 水迷宮測試儀(成都泰盟科技有限公司)；Fabius麻醉機；Vamos氣體監護儀(Draeger公司，德國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司型號1X71)；吸入麻醉箱(自制)；恒溫培養箱(ABI-7500)；β-淀粉樣蛋白(Aβ，Abcam)；Tau蛋白(武漢三鷹)。

1.2實驗動物及分組 20月齡健康雄性SD老年大鼠25只，體重450～550 g，由重慶第三軍醫大學實驗動物中心提供〔SCXK(渝)2012-0005〕。采用隨機數字表法分為對照組(C組，n=5)和實驗組(n=20)，其中實驗組分為4個亞組即麻醉后蘇醒2 h(D-2)組、12 h(D-12)組、24 h(D-24)組、72 h(D-72)組，每組5只。

1.3實驗方法 水迷宮實驗開始前1 d，所有大鼠先行Morris水迷宮適應性訓練，剔除不會游泳的大鼠。定位航行實驗(5 d)：設置平臺與水面距離為2 cm，每只大鼠每天訓練4次。大鼠分別于東、南、西、北4個象限中點面向池壁入水，限定大鼠在120 s內找到并爬上平臺休息10 s，若120 s內未找到，則引導其找到并置于平臺上休息10 s，記錄逃避潛伏期。空間探索實驗(1 d)：第6天移除平臺，將所有大鼠從第四象限入水，游泳120 s，記錄有效區域運動時間、有效區域運動距離、有效區域進入次數。Morris水迷宮訓練完成后，C組于自制吸入麻醉箱中吸入1 L/min空氣+1 L/min O230 min；實驗組均吸入8%地氟烷30 min。C組、D-2組在分別吸入1 L/min空氣+1 L/min O2和8%地氟烷30 min后完全蘇醒2 h行Morris水迷宮實驗并取材；D-12組、D-24組、D-72組于地氟烷麻醉完全蘇醒后12、24、72 h再次行Morris水迷宮實驗并取材。

1.4免疫熒光檢測海馬Aβ、Tau蛋白 Morris水迷宮實驗結束當天，各組大鼠于各時間點分別腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉生效后處死，取海馬組織石蠟包埋切片，待切片干燥后復水；抗原修復：將切片浸泡在抗原修復液中；過氧化物酶滅活：H2O2室溫孵育；封閉；孵育一抗：將Tau和Aβ按1∶100稀釋后滴加至組織上37℃ 2 h；孵育二抗：將兔二抗按1∶100稀釋后滴加至組織上37℃ 1 h；染核：將Hochest染色液滴加至組織上室溫15 min；脫水；在切片上滴加封片液(甘油和抗猝滅劑1∶1混合)；蓋上蓋玻片，封片；顯微鏡觀察并拍照。

2 結 果

2.1行為學結果 麻醉前逃避潛伏期與總路程隨著時間的推移逐漸縮短，第2～5天逃避潛伏期及總路程均顯著短于第1天(P<0.01，P<0.05)，見表1。

表1 大鼠水迷宮訓練逃避潛伏期與總路程

麻醉后各組有效區域運動時間、有效區域運動距離、有效區域進入次數差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 麻醉后各組大鼠空間探索實驗結果的比較

2.2海馬內Tau、Aβ蛋白表達比較 大鼠海馬內Tau、Aβ蛋白的表達量各組間比較，差異無統計學意義(P>0.05),見表3、圖1。

表3 各組海馬Tau、Aβ蛋白表達比較

圖1 免疫熒光法檢測各組大鼠海馬Aβ、Tau蛋白的表達(Hochest，×100)

3 討 論

有關術后認知功能障礙(POCD)的發病機制目前仍不明確，研究已經表明，年齡是POCD的眾多影響因素中唯一明確的危險因素，接受大手術治療的老年患者POCD的發生率為30%～40%，部分患者可持續至3個月〔2〕，鑒于此，本次研究選擇的研究對象為老年大鼠。

Morris水迷宮常應用于學習記憶腦機制研究，現已成為阿爾茨海默病基礎研究中評價動物學習記憶的經典方法〔3〕。海馬是腦內具有學習和記憶功能的重要結構，當大腦皮質中的神經元接收到各種知覺和感官訊息時，其會迅速將訊息傳遞給海馬，海馬損傷將導致大鼠學習記憶能力受損。過度磷酸化的Tau蛋白在腦內形成各種沉積物，沉積在神經元細胞內，引起神經元損害、變性。Aβ蛋白能在細胞基質中沉積并具有神經毒性，可激活小膠質細胞等促進神經元細胞凋亡，破壞神經系統。研究結果顯示，Aβ過度沉積和Tau蛋白過度磷酸化是各種原因誘發學習記憶下降的共同通路〔4,5〕。

有關地氟烷麻醉對學習記憶能力是否造成影響報道不一致〔6～8〕。本研究根據前期的預實驗結果選擇8%地氟烷為研究使用濃度〔9〕。

本研究結果提示，老年大鼠吸入8%的地氟烷麻醉30 min后，學習記憶能力未出現下降。實驗進一步通過對各實驗組的大鼠海馬內Aβ、Tau蛋白的檢測發現，在各組大鼠海馬和大腦皮層區域的Aβ、Tau蛋白表達高，其他部位表達近乎于無，與對照組相比較，各組間的蛋白表達呈現上升趨勢，但差異不明顯，表明大鼠海馬內Aβ、Tau蛋白的表達盡管出現一定量的增加，但不足以對老年大鼠的空間學習記憶能力造成損害。Callaway等〔10〕的研究表明地氟烷對學習記憶能力的損害呈現劑量和年齡依耐性，老年大鼠在吸入最低有效肺泡濃度的地氟烷4 h，1 w后測試其學習記憶能力沒有損害，與本研究結果一致。而與文獻〔11〕的報道研究結果不一致，可能為研究使用的吸入藥物濃度和麻醉時間不同所導致。

綜上所述，使用地氟烷短時間麻醉影響大鼠海馬內Aβ、Tau蛋白的表達增加，但未造成老年大鼠的短期學習記憶能力下降。有關地氟烷在認知功能方面的影響仍需進一步廣泛且深入地開展相關研究，從而更好地為臨床提供數據支持。