近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)鑒別防風(fēng)原產(chǎn)地

李 斌， 蓮 花， 布 仁， 渠 弼， 白文明

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricate(Turcz.)Schischk.的干燥根，主產(chǎn)于我國內(nèi)蒙古、遼寧、河北等北方或東北地區(qū)[1]，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙等功效[2]。防風(fēng)中含有豐富的香豆素、色原酮、多糖、聚乙炔類成分[3]，研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)具有抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、陣痛、消化性潰瘍，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，抗痙攣、抗炎、抗腫瘤等活性[4-8]。東北三省和內(nèi)蒙古是防風(fēng)的道地產(chǎn)區(qū)，其在我國境內(nèi)的分布較廣，受到生長環(huán)境的影響，藥效成分的含量及臨床藥效等均可能出現(xiàn)較大差異[9]。加之，我國中藥材市場普遍存在混用、亂用及以次充好等現(xiàn)象，使得防風(fēng)產(chǎn)地的鑒別非常重要。

近紅外分光譜法以其能夠進(jìn)行快速、無損分析的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥材質(zhì)量控制的研究[10-13]。雖然有報道基于(中)紅外光譜法可有效地判別不同產(chǎn)地的防風(fēng)[14]，但該方法需要將樣品壓片，耗時費(fèi)力，無法滿足在線分析的要求。

本研究采集并購買內(nèi)蒙古自治區(qū)(赤峰)、遼寧(阜新)、河北、甘肅、黑龍江這5個產(chǎn)地防風(fēng)，利用漫反射方式采集近紅外光譜，結(jié)合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)等方法，建立預(yù)測防風(fēng)產(chǎn)地屬性的快速無損分析方法。

1 材料

1.1 儀器 NIRMaster傅里葉變換近紅外光譜儀(瑞士Buchi公司)；DFY-1000C中藥粉碎機(jī)(上海左樂儀器有限公司)；JET1002G/00電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 防風(fēng) 防風(fēng)共5批，分別為2019年采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰、遼寧省阜新境內(nèi)的2批，以及2018年購自河北、甘肅、黑龍江防風(fēng)市場的3批，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室渠弼副教授鑒定為正品，按每份約50 g的量分成若干份，中藥粉碎機(jī)粉碎，共得到內(nèi)蒙古產(chǎn)15份、遼寧產(chǎn)15份、河北產(chǎn)30份、甘肅產(chǎn)30份、黑龍江產(chǎn)30份。

2 方法

2.1 分析條件 溫度24～26 ℃；相對濕度45%～50%；粉末累積掃描次數(shù)32次；掃描范圍10 000～4 000 cm-1；分辨率為8 cm-1。

2.2 樣品測定 采用積分球漫反射法，將防風(fēng)粉末置于樣品杯中，自動旋轉(zhuǎn)測量3個位置的近紅外光譜，結(jié)果見圖1。

2.3 數(shù)據(jù)分析 本研究采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)建立判別不同產(chǎn)地防風(fēng)的判別模型，并通過外部未知樣品對判別模型進(jìn)行驗(yàn)證。為了使不同產(chǎn)地防風(fēng)光譜之間具有可比性，在建立相應(yīng)模型前將對漫反射近紅外光譜進(jìn)行K-M轉(zhuǎn)換[15]；為了分離重疊吸收峰，并校正基線漂移和光散亂對近紅外光譜有效信息的影響，采用基于Savitzky-Golay算法的微分處理法(1階、2階微分)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換處理法(SNV)對光譜進(jìn)行前處理。

圖1 不同產(chǎn)地防風(fēng)近紅外光譜圖

將不同產(chǎn)地防風(fēng)進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為校正組95份(內(nèi)蒙古、遼寧產(chǎn)各10份，河北、甘肅、黑龍江產(chǎn)各25份)、驗(yàn)證組25份(各產(chǎn)地5份)。參照文獻(xiàn)[16-17]報道，基于校正組防風(fēng)的近紅外光譜進(jìn)行PCA分析，將近紅外光譜在各載荷上的得分投影到坐標(biāo)系中，確定能表征不同產(chǎn)地防風(fēng)差異的2個載荷，相同產(chǎn)地防風(fēng)近紅外光譜將出現(xiàn)在坐標(biāo)系的相近區(qū)域，而不同產(chǎn)地的將出現(xiàn)在坐標(biāo)系的較遠(yuǎn)區(qū)域，從而可進(jìn)行區(qū)分。為了評價所建立模型的優(yōu)劣，選用校正組以外的防風(fēng)(驗(yàn)證組)來驗(yàn)證模型對未知樣品的鑒別能力。

參照文獻(xiàn)[18]報道，定義驗(yàn)證組防風(fēng)的95個近紅外光譜為自變量(X)，各近紅外光譜的分組信息為因變量(Y)。由于本研究所用防風(fēng)來源于5個產(chǎn)地，所以每1個近紅外光譜(自變量)對應(yīng)的因變量數(shù)為5個，每1個因變量代表1個產(chǎn)地，當(dāng)該因變量代表的產(chǎn)地與對應(yīng)的近紅外光譜的產(chǎn)地一致時取值1，否則取值-1，再基于驗(yàn)證組防風(fēng)的自變量及因變量數(shù)據(jù)，利用PLS2算法建立判別防風(fēng)產(chǎn)地的數(shù)學(xué)模型。為了避免監(jiān)督學(xué)習(xí)算法出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，選用驗(yàn)證組的樣品對預(yù)測模型的優(yōu)劣進(jìn)行評價，由于PLS2算法給出的預(yù)測結(jié)果為5個變量數(shù)值，故最接近1的變量所代表的產(chǎn)地即為防風(fēng)原產(chǎn)地。另外，也可通過主成分分析對預(yù)測得到的因變量數(shù)據(jù)(PLS2模型獲得的預(yù)測數(shù)值)進(jìn)行降低維度處理后，以二維坐標(biāo)散點(diǎn)圖中的樣品分布區(qū)域(99.9%等概率區(qū)域)來判斷防風(fēng)原產(chǎn)地，即相同產(chǎn)地防風(fēng)出現(xiàn)在二維坐標(biāo)系的相近區(qū)域內(nèi)，不同產(chǎn)地的出現(xiàn)在較遠(yuǎn)的區(qū)域。然后，采用坐標(biāo)系散點(diǎn)圖的方式表示原產(chǎn)地預(yù)測結(jié)果，數(shù)據(jù)解析均基于FreeMat v4.0軟件完成。

3 結(jié)果

3.1 PCA 圖2顯示，除校正組(圖2a)外，其余各組前處理光譜建立的模型都能將不同原產(chǎn)地防風(fēng)進(jìn)行分離，并且無重疊；99.9%等概率區(qū)域(橢圓處)無重疊，其中基于2階微分加SNV處理光譜的鑒別模型對校正組中不同產(chǎn)地防風(fēng)的分離效果最佳，并對驗(yàn)證組防風(fēng)具有同樣的鑒別效果(圖2f)，原產(chǎn)地鑒別的準(zhǔn)確率為100%，故確定該模型為防風(fēng)原產(chǎn)地的鑒別模型；內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧省產(chǎn)防風(fēng)的等概率橢圓區(qū)域相對較大，即相同原產(chǎn)地的組內(nèi)差異比其他原產(chǎn)地大，其原因可能是建立判別模型時上述2個產(chǎn)地的防風(fēng)較少，導(dǎo)致通過PCA獲得的主成分所代表的與這2個產(chǎn)地防風(fēng)特征有關(guān)的信息量降低，從而使組內(nèi)差異變大。

圖2 基于校正組近紅外光譜建立的鑒別模型及驗(yàn)證組防風(fēng)鑒別結(jié)果(Ⅰ)

圖3顯示，4 344、4 444 cm-1位置附近的載荷值較大，表明近紅外吸收對判別模型的判別結(jié)果起到了顯著作用，是不同產(chǎn)地防風(fēng)差異的關(guān)鍵因素；該處吸收峰主要來源于C-H基團(tuán)的合頻振動，在近紅外光譜的對應(yīng)位置(圖1a)上可觀察到強(qiáng)度較大者。另外，通過觀察經(jīng)前處理(2階微分+SNV)后的低波數(shù)段的擴(kuò)大圖(圖1b)發(fā)現(xiàn)，上述2個波數(shù)位置附近吸收強(qiáng)度及吸收峰形狀有較大差異。

圖3 主成分分析載荷圖

圖4顯示，不同產(chǎn)地防風(fēng)近紅外光譜差異主要出現(xiàn)在低波數(shù)段，表明與該波數(shù)段吸收源對應(yīng)的成分在不同產(chǎn)地防風(fēng)中含量或分布狀況可能存在明顯差異，可得到很好的分離。

3.2 PLS-DA 圖5顯示，光譜前處理的有無對防風(fēng)原產(chǎn)地判別結(jié)果的影響較小，即產(chǎn)地鑒別模型能很好地將不同產(chǎn)地防風(fēng)進(jìn)行分離，而且99.9%等概率區(qū)域(橢圓處)無重疊。綜合考慮散點(diǎn)圖上校正組防風(fēng)各點(diǎn)的分散情況和模型對驗(yàn)證組防風(fēng)的預(yù)測準(zhǔn)確度(圖5e)，最終選擇基于二階微分處理光譜的PLS2算法為建立模型的方法，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧省產(chǎn)防風(fēng)的等概率橢圓區(qū)域相對較大，表明這2個產(chǎn)地防風(fēng)組內(nèi)差距比其他產(chǎn)地大，與PCA結(jié)果一致，其主要原因?yàn)楫?dāng)?shù)胤里L(fēng)數(shù)較少。

圖6顯示，5 028、4 924、4 664、4 472 cm-1附近的取值較大，表明上述波數(shù)處吸光度對判別結(jié)果的貢獻(xiàn)率較高，與上述波數(shù)對應(yīng)的吸收源(成分)可能是不同產(chǎn)地防風(fēng)差異的關(guān)鍵因素；該處吸收峰主要來源于C-H基團(tuán)的合頻振動，近紅外光譜(圖1a)對應(yīng)位置上可觀察到明顯較強(qiáng)的一系列吸收峰，與PCA結(jié)果一致，進(jìn)一步證明是該波數(shù)段對應(yīng)成分的含量或分布狀況等在不同產(chǎn)地防風(fēng)之間產(chǎn)生差異，可得到很好的分離。

圖4 不同產(chǎn)地防風(fēng)差光譜散點(diǎn)圖

圖5 基于校正組近紅外光譜建立的鑒別模型及驗(yàn)證組防風(fēng)鑒別結(jié)果(Ⅱ)

圖6 PLS-DA模型的回歸系數(shù)散點(diǎn)圖

4 討論

防風(fēng)是典型的道地藥材，藥用價值與原產(chǎn)地有著密切的關(guān)系，所以防風(fēng)的原產(chǎn)地鑒別是其質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。本研究基于近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法，建立通過防風(fēng)的近紅外光譜預(yù)測原產(chǎn)地的快速、無損分析方法，且該方法的預(yù)測精度符合實(shí)際應(yīng)用的要求。不同產(chǎn)地防風(fēng)的藥效存在較大差異，而造成藥效差異的原因非常復(fù)雜，可能是多個藥效成分協(xié)同作用的結(jié)果，所以很難用單一或幾個化學(xué)成分的含量來評價其藥用價值。近紅外光譜的吸收主要來源于分子中含氫基團(tuán)的倍頻和合頻振動，理論上中草藥中含有的全部有機(jī)物都將在該波段產(chǎn)生光譜吸收，即防風(fēng)的近紅外光譜幾乎包含了所有藥效成分的光譜信息。利用近紅外光譜法對防風(fēng)原產(chǎn)地進(jìn)行鑒別分析，實(shí)際上是以防風(fēng)中含有的絕大部分藥效物質(zhì)為基礎(chǔ)進(jìn)行的判別分析。所以，判別結(jié)果反映的是防風(fēng)整體性質(zhì)的差異，迎合中藥質(zhì)量控制過程中整體評價藥材屬性的最新研究思路。本研究建立的防風(fēng)原產(chǎn)地鑒別方法的操作非常簡單，僅需要將防風(fēng)進(jìn)行粉碎后采集近紅外光譜，并將近紅外光譜帶入數(shù)學(xué)模型即可。不僅分析速度快、樣品前處理簡單，而且光譜檢測前后藥材的藥用屬性不發(fā)生變化，有潛力作為制劑過程中中藥材原產(chǎn)地篩選的在線分析技術(shù)，提高中藥材質(zhì)量控制的現(xiàn)代化程度。