桔梗中PgMCT和PgCMK的克隆及原核表達分析

劉夢麗， 余函紋， 李 景， 徐 睿， 吳君賢， 彭華勝,2， 查良平*， 桂雙英,3,4,5*

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.中國中醫科學院中藥資源中心，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；3.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；4.現代藥物制劑安徽省教育廳工程技術研究中心，安徽 合肥 230012；5.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq)A.DC 的干燥根，始載于《神農本草經》[1]，性平，味苦、辛，歸肺經[2]，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效，臨床用于肺癰吐膿、咽痛音啞、胸悶不暢、咳嗽痰多[3]，是一種傳統“引經”藥，可載藥上行直達病所[4-5]。現代研究表明，桔梗中含有皂苷、甾醇、黃酮、氨基酸、多糖及微量元素等多種化學成分[6-7]，其中三萜皂苷為其主要活性成分[8]，具有祛痰、鎮咳、抗炎、保肝、抗腫瘤及免疫調節等多種藥理活性[9-11]。

三萜皂苷是一類具有多種生理功能的次生代謝產物，在自然界中分布廣泛[12]，其中雙子葉植物中含量最佳、分布最多，可以增強植物抗病和抗蟲害能力，是中藥材藥用有效成分的重要組分[13]。桔梗皂苷類成分均屬于齊墩果烷型五環三萜皂苷[14]，通過萜類化合物的生物合成途徑產生，即細胞質中甲羥戊酸途徑(MVA)和質體中的甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑[15-16]。MEP途徑第一步是由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸縮合生成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)，其次，由1-氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶通過還原反應將DXP催化生成MEP。隨后，通過2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胱氨酰轉移酶(MCT)、4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤蘚糖醇激酶(CMK)等一系列酶促反應將MEP磷酸化、環化等生成異戊烯基焦磷酸(IPP)與二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)[17-19]。

目前，MCT和CMK基因已經從多種植物中成功克隆，例如巴西[20]、杜仲[21]、銀杏[22]、南方紅豆杉[23]、黃花蒿[24]，而桔梗MCT和CMK基因尚未有報道。本文首次從桔梗中克隆得到MEP途徑的關鍵酶基因PgMCT和PgCMK的全長序列，進行序列分析，構建原核表達載體并轉化到大腸桿菌中進行誘導表達，為深入研究桔梗三萜皂苷的生物合成分子機制奠定基礎。

1 材料

1.1 藥材 桔梗來源于安徽省桐城市唐灣鎮013縣道，采取2年生桔梗，收集根、莖和葉，經液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 細胞與試劑 Trans1-T1感受態細胞、Transetta(DE3)感受態細胞購自于北京全式金生物技術有限公司。原核表達載體購自于武漢淼靈生物科技有限公司，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 基因數據獲取 桔梗PgMCT和PgCMK基因序列來源于桔梗轉錄組數據(本實驗室)，經冗余序列去除和組裝，功能注釋后分類。GenBank數據庫獲取其他物種的MCT和CMK氨基酸序列。

2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 以桔梗根部為材料，根據RNA prep Pure Plant Kit試劑盒說明書提取得到桔梗根部總RNA，電泳檢測桔梗總RNA的完整性，ND2000(Denovix DS-11+, S-03512)測定RNA的A260和A280值，以桔梗RNA為模板進行反轉錄，得到桔梗cDNA。

2.3 桔梗PgMCT和PgCMK基因的克隆 根據桔梗轉錄組數據庫，設計PgMCT和PgCMK基因特異性引物。PgMCT正向引物ATGGCAATTCTGCAAGTCTGTCTCC，反向引物TTATGATGACTCTTCAGAAGTGCCA；PgCMK正向引物ATGGCTTCAACCCAGTTGCTCAGTT，反向引物CTAATCAG CAGACACAAAAGGGTCA。以桔梗根部cDNA為模板進行PCR擴增，經電泳分離、檢測，進行切膠回收。將目的基因與克隆載體于25 ℃連接3 h，轉化至Trans1-T1感受態細胞，經菌液PCR驗證，陽性菌液送至公司完成測序。

2.4 桔梗PgMCT和PgCMK基因的生物信息學分析 使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線工具BLAST對PgMCT和PgCMK基因序列進行同源比對分析；運用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/ orffinder/)查找基因的開放閱讀框(ORF)；ExPASy(https://web.expasy.org /protparam/)預測基因編碼蛋白的理化性質；利用NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測蛋白質二級結構；使用Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)進行三維結構建模，結合PyMOL軟件預測蛋白質的三級結構；CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白質結構域；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行蛋白序列的跨膜結構域分析；SinalP4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白序列的信號肽預測分析；運用ClustalW軟件，將PgMCT和PgCMK氨基酸序列與其他植物的氨基酸序列進行比對，用MEGA 6.06軟件構建Neighbor-joining系統進化樹，bootstrap重復次數為1 000次。

2.5 桔梗PgMCT和PgCMK基因的原核表達 依據測序所得序列，在PgMCT和PgCMK基因核苷酸序列兩側設計帶有BamHI酶切位點的特異性引物，PgMCT-32a-BamHI正向引物AGGCCATGGCTGATATCGGAATGGCAATTCTG CAAGTCTGTCTCC，反向引物CGACGGAGCTCGAATTCG GACTAATCAGCAGACACAAAAGGGTCA；PgCMK-28a-BamHI正向引物GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGCTT CAACCCAGTTGCTCAGTT，反向引物CGACGGAGCTCGA ATTCGGATTATGATGACTCTTCAGAAGTGCCA。以重組質粒為模板，經PCR擴增、檢測，進行切膠回收。同時對pET-32a、pET-28a載體進行BamH Ⅰ單酶切，經電泳檢測，進行切膠回收。在50 ℃條件下，目的基因與原核表達載體完成無縫拼接，產物轉化至Trans1-T1感受態細胞，挑取單菌落，菌液PCR驗證并挑選陽性菌液送至公司測序。將測序陽性、包含目的基因的質粒轉化至大腸桿菌Transetta(DE3)中，37 ℃下至OD600值為0.6～0.8時，將pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK分別在0.8、0.4 mmol/L的IPTG條件下，28 ℃誘導12 h，收集菌液，完成SDS-PAGE檢測。

3 結果

3.1 桔梗PgMCT和PgCMK基因克隆和序列分析 依據桔梗轉錄組數據文庫PgMCT和PgCMK的基因序列分析，以桔梗cDNA為模板，經過PCR擴增，電泳分離、檢測，結果顯示，PgMCT基因電泳條帶約為954 bp(圖1A)，PgCMK基因電泳條帶約為1 227 bp(圖1B)。PgMCT和PgCMK基因cDNA序列分析結果顯示，PgMCT基因ORF全長954 bp，編碼317個氨基酸，PgCMK基因ORF全長1 227 bp，編碼408個氨基酸，與目的基因條帶大小一致。

PgMCT和PgCMK蛋白序列通過Genebank中BLASTX進行序列比對，結果顯示，PgMCT和PgCMK與GenBank中已注冊植物基因有較高的同源性，桔梗MCT與萵苣LsMCT(XP_023729231.1)同源相似性為78.91%，與獼猴桃(PSS29099.1)同源相似性為74.48%，將該基因命名為PgMCT，GenBank注冊號為MZ736414。桔梗CMK與茶(XP_028107767.1)同源相似性為80.35%，與水忍冬(AGE10579.1)同源相似性為77.04%，將該基因命名為PgCMK，GenBank注冊號為MZ736415。

3.2 桔梗PgMCT和PgCMK基因的生物信息學分析

3.2.1 蛋白理化性質分析 根據PgMCT和PgCMK的氨基酸序列，利用ExPASy在線工具對桔梗PgMCT和PgCMK蛋白理化性質分析，結果顯示，PgMCT編碼的蛋白質分子式為C1576H2516N420O479S9，編碼317個氨基酸，相對分子質量35 300.38，理論pI 6.27，脂肪指數94.95，不穩定性系數(Ⅱ)為43.68；PgCMK編碼的蛋白質分子式為C1978H3105N543O606S12，編碼408個氨基酸，相對分子質量44 573.41，理論pI 7.54，脂肪指數81.54，不穩定性系數(Ⅱ)為44.23。理論上PgMCT和PgCMK蛋白均為不穩定蛋白。

3.2.2 蛋白二級結構和三級結構預測分析 采用NPS在線分析軟件預測PgMCT和PgCMK蛋白質的二級結構(圖2A、2B)，結果顯示，PgMCT中含有83個α-螺旋，占比26.18%；延伸鏈為78個，占比 24.61%；β-轉角為26個，占比8.20%；無規卷曲為130個，占比41.01%；PgCMK中含有139個α-螺旋，占比34.07%；延伸鏈為69個，占比16.91%；β-轉角為25個，占比6.13%；無規卷曲為175個，占比42.89%，這兩種蛋白的二級結構中所占比例最高的均為無規卷曲。

通過SWISS-MODEL Workspace在線軟件對PgMCT和PgCMK蛋白進行同源建模，構建三維空間模型(圖2C、2D)，通過ExPAsy structure assessment程序評測推導PgMCT蛋白模型2yc3.1.A 序列相似性為77.97%，GMQE值為0.62。PgCMK蛋白模型2vf3.1.A序列相似性為31.08%，GMQE值為0.45。

圖2 PgMCT和PgCMK的二級和三級結構預測

3.2.3 蛋白結構功能域及跨膜結構域分析 利用NCBI的Conserved domains在線工具對PgMCT和PgCMK蛋白結構功能域進行預測分析(圖3A、3B)，結果顯示，PgMCT屬于糖基轉移酶GT-A超家族；PgCMK具有IspE功能域，屬于IspE超家族。用TMHMM2.0在線工具對PgMCT和PgCMK跨膜結構域進行預測分析(圖3C、3D)，結果顯示，PgMCT和PgCMK均未出現跨膜結構或膜結合區域，推測這個兩個蛋白為非跨膜蛋白。

圖3 PgMCT和PgCMK的結構功能域和跨膜結構域

3.2.4 氨基酸序列同源比對 采用DNAMAN軟件對桔梗MCT和CMK氨基酸序列進行比對，見圖4。PgMCT與茶CsMCT(XP_028127240.1)、向日葵HaMCT(XP_022038869.1)、萵苣LsMCT(XP_023729231.1)、木薯MeMCT(XP_021592947.1)氨基酸序列的一致性為73.81%，5種植物MCT的N端非催化區域氨基酸序列是序列對比的主要差異，保守區主要集中在中部和尾部，具有依賴于Mg2+的底物CTP結合位點和底物MEP結合位點。將PgCMK氨基酸序列與長春花CrMCT(ABI35992.1)、杜仲EuCMK(AQZ26750.1)、水忍冬LdCMK(AGE10579.1)、山銀花LhCMK(AGE10580.1)氨基酸序列的一致性為85.33%。發現PgCMK和其他植物的CMK蛋白均具有3個典型結合域Motif A、Motif B和Motif C。

圖5 PgMCT和PgCMK與其他物種MCT、CMK氨基酸序列的系統進化分析

3.2.5 系統進化樹分析 從GenBank數據庫中選取其他植物的MCT和CMK基因的氨基酸序列，利用MEGA 6.06軟件通過鄰接法構建包括桔梗在內的MCT和CMK氨基酸序列的系統進化樹(圖5)。結果顯示，系統進化樹聚集為5種類型，即雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、藻類和菌類。PgMCT與萵苣MCT、橡膠草MCT、向日葵MCT聚為一支，表明其親緣關系最高。PgCMK與罌粟CMK、非洲相思子CMK、桑CMK、棗CMK聚為一支，表明2者具有較高的親緣關系。Ls.萵苣Lactucasativa；Tk.橡膠草Taraxacumkok-saghyz；Ha.向日葵Helianthusannuus；Rv.蘿芙木Rauvolfiaverticillata；Of.桂花Osmanthusfragrans；Ir.碎米椏Isodonrubescens；Pv.夏枯草Prunellavulgaris；Cs.茶Camelliasinensis；Ma.桑樹Morusalba；Zj.棗Ziziphusjujuba；Bo.紅木Bixaorellana；Hb.橡膠樹Heveabrasiliensis；Me.木薯Manihotesculenta；At.擬南芥Arabidopsisthaliana；Pk.思茅松Pinuskesiya；Tc.紅豆杉Taxuschinensis；Zm.玉米Zeamays；Bp.綠藻Bathycoccusprasinos；Ol.鞭毛藻Ostreococcuslucimarinus；Gs.硫還原地桿菌Geobactersulfurreducens；Ma.桑樹Morusalba；Zj.棗Ziziphusjujuba；Ap.相思子Abrusprecatorius；Ps.罌粟Papaversomniferum；Eu.杜仲Eucommiaulmoides；Vv.葡萄Vitisvinifera；Ca.小粒咖啡Coffeaarabica；Sm.丹參Salviamiltiorrhiza；Of.桂花Osmanthusfragrans；Nt.煙草Nicotianatabacum；Sl.番茄Solanumlycopersicum；Lh.菰腺忍冬Lonicerahypoglauca；Aa.黃花蒿Artemisiaannua；Ao.石刁柏Asparagusofficinalis；Zm.玉米Zeamays；Gb.銀杏Ginkgobiloba；Gs.紅藻Galdieriasulphuraria；Es.長囊水云Ectocarpussiliculosus；Ab.鮑曼不動桿菌Acinetobacterbaumannii；Ec.大腸桿菌Escherichiacoli。

3.3 PgMCT和PgCMK原核表達載體構建及誘導表達 將重組質粒pET-32a-PgMCT、pET-28a-PgCMK轉化至大腸桿菌Transetta(DE3)中，經過菌液PCR及公司測序驗證，得到陽性菌株。以pET-32a和pET-28a轉入大腸桿菌Transetta(DE3)感受態細胞作為對照，觀察重組融合蛋白pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK經過IPTG誘導后的蛋白表達情況，SDS-PAGE電泳結果顯示(圖6)，pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK在大腸桿菌Transetta(DE3)中，全菌和沉淀中均有目的基因的表達，分別在55、50 kDa出現條帶，與預測結果一致，而上清液中均沒有目的基因的表達，沉淀中出現目的蛋白，表明兩種蛋白是以包涵體形式存在。

注：M為 Marker，A1為pET-32a空載，A2為未誘導的pET-32a-PgMCT菌株，A3為IPTG誘導的pET-32a-PgMCT菌株，A4為IPTG誘導的pET-32a-PgMCT上清液，A5為IPTG誘導的pET-32a-PgMCT沉淀，B1為pET-28a空載，B2為未誘導的pET-28a-PgCMK菌株，B3為IPTG誘導的pET-28a-PgCMK菌株，B4為IPTG誘導的pET-28a-PgCMK上清液，B5為IPTG誘導的pET-32a-PgCMK沉淀。圖6 PgMCT(A)和PgCMK(B)重組蛋白原核表達

4 討論

桔梗是傳統的藥食兩用中藥材品種之一[25]，其主要成分為結構和功能多樣的萜類化合物，是由共同的結構前體物質IPP與DMAPP合成[26]，這2種前體的生物合成途徑包括細胞質中的MVA途徑和質體中MEP途徑[16]。近年來，MEP途徑是植物次生代謝調控研究的熱點領域，MCT和CMK是MEP途徑中的關鍵酶。

目前，MCT和CMK基因已經從多種不同植物中成功克隆，并驗證其蛋白功能。簡東琴等[23]從南方紅豆杉中克隆了TcMCT基因的cDNA序列全長，研究發現TcMCT基因在綠色樹皮中的表達量最高，并在大腸桿菌中超表達，驗證TcMCT基因可促進β-胡蘿卜素大量積累，證實MCT基因對于萜類物質的生物合成的重要性。本研究生物信息學分析表明PgMCT屬于糖基轉移酶GT-A超家族，與青蒿MCT[27]結構域預測結果一致，推測為非跨膜蛋白。PgMCT與其他植物的MCT進行同源性比對，表明不同植物MCT蛋白的N端氨基酸序列保守性較差，保守區主要集中在中部和尾部，均具有底物CTP結合位點和底物MEP結合位點。王學勇等[28]從丹參毛狀根中克隆SmCMK基因的全長cDNA序列，初步驗證茉莉酸甲酯誘導下SmCMK基因表達量與丹參酮類成分的積累呈正比關系。本研究預測PgCMK屬于IspE超家族，與雷公藤[29]結構域預測結果一致，推測為非跨膜蛋白。PgCMK與其他植物的CMK進行同源性比對，表明不同植物的CMK蛋白均具有三個典型結合域Motif A、Motif B和Motif C，其中，Motif A是底物的結合位點；Motif B富含甘氨酸，是ATP結合位點和活性位點；Motif C是穩定Motif A和Motif B兩個位點的保守區域，發揮穩定蛋白的作用。

大腸桿菌原核表達系統是目前應用最廣泛的制備多克隆抗體的外源蛋白表達系統，具有菌種遺傳背景和生化特性清楚、培養條件簡單、成本低及周期短等特點[30-31]。在大腸桿菌中，外源基因的表達受很多因子的影響，包括目的基因結構的特性、溫度、IPTG濃度、pH值和時間等[32]。本研究構建表達載體pET-32a-PgMCT、pET-28a-PgCMK，分別在0.8、0.4 mmol/L IPTG的誘導下，28 ℃培養12 h后，在大腸桿菌Transetta(DE3)中正確表達，且有較高的表達量，以包涵體的形式存在。包涵體蛋白一般沒有生物活性，但其形成是宿主細胞對于外源有害蛋白高效表達的一種保護機制，可以增加蛋白質結構的穩定性，有利于減少表達蛋白的降解[33]。同時，包涵體中雜蛋白的含量較少，經過簡單的分離與純化，可以得到純度較高的目的蛋白[34]。

本研究從桔梗中首次克隆得到了PgMCT和PgCMK基因，其ORF全長分別為954、1 227 bp，推測分別編碼317、408個氨基酸，均為不穩定蛋白。構建了重組質粒pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK，轉化至大腸桿菌Transetta(DE3)中誘導蛋白表達，結果顯示PgMCT和PgCMK在大腸桿菌中表達量較高，以包涵體形式存在。下一步研究可以通過包涵體溶解與復性的方式，獲得有活性的PgMCT和PgCMK蛋白，研究其體外酶學特征，為功能鑒定提供物質基礎。MEP途徑參與桔梗三萜皂苷的生物合成，該途徑中多個基因的表達量對萜類化合物產量具有決定性影響，因此對桔梗MEP途徑中關鍵酶基因的研究，為桔梗三萜皂苷成分的生物合成奠定了物質基礎。