蛇黃凝膠處方工藝的優(yōu)化

田 斌， 瞿孝蘭， 林義平， 宋 英， 袁強華*

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

濕疹是一種以劇烈瘙癢與皮膚炎癥為主要癥狀，伴有干燥、脫落、滲液、出血等的過敏性炎性反應性皮膚病[1]，臨床上常根據(jù)其皮損表現(xiàn)分為急性濕疹、亞急性濕疹、慢性濕疹。中醫(yī)認為，濕疹發(fā)病原因與先天稟賦不足后外感風、濕、熱等邪氣，內熱外熱相結合發(fā)于肌膚相關[2-3]；西醫(yī)認為，它主要與遺傳因素、環(huán)境因素、藥物因素、免疫因素、腸道與皮膚微生物群落失調、腸黏膜屏障功能異常有關[4-7]。

目前，治療濕疹以消除皮膚炎癥和感染,保護和恢復皮膚屏障功能，控制惡化因素為主要目標[8]，常用藥物包括類固醇、皮質類激素、抗組胺藥物、抗生素、糖皮質激素、局部鈣調神經磷酸酶抑制劑等[9]，但長期使用后會引起皮膚干燥、脆性增加，色素沉著與多毛，皮膚皺縮、皺襞等不良反應[10]。中藥外治濕疹大多用清熱燥濕解毒、殺蟲止癢藥[11]，從而達到止癢、抗炎、殺菌的目的，其中蛇黃軟膏由黃柏、蛇床子組成，用于治療亞急性濕疹，但其采用原粉入藥，存在載藥量較小、單次用量大、有效成分逸出緩慢等弊端。凝膠劑作為近年來外用制劑的研究熱點，具有穩(wěn)定性較好、附著性強、釋藥穩(wěn)定、涂布均勻、易清洗、不污染衣物等優(yōu)點[12]，故本實驗開發(fā)新制劑蛇黃凝膠以解決上述問題。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BP-211D型電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；LE204E型電子天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；KH-250B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；PHS-3C型酸度計(上海精密儀器科學有限公司)；DF-101Z型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海秋佐科學儀器有限公司)；TG-20型臺式高速離心機(四川蜀科儀器有限公司)；DHG-9023A小型臺式干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 鹽酸黃柏堿(批號111895-201504，純度94.9%)、鹽酸小檗堿(批號110713-201613，純度86.8%)、蛇床子素(批號110822-201710，純度99.5%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；歐前胡素對照品(批號191120，純度98%)購自成都植標化純生物技術有限公司。殼聚糖(批號20032504)、羥丙甲纖維素(批號19041504)均購自湖南新綠方藥業(yè)有限公司；羧甲纖維素鈉(批號TF78200401)購自湖南九典宏陽制藥有限公司；卡波姆940(批號20200522)購自博新化工原料有限公司；甘油(批號000120180804)購自湖南爾康制藥股份有限公司，生理鹽水(批號18081611)購自四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司；透析袋(截留分子量3 500)。磷酸、乙腈均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 黃柏-蛇床子提取物制備 采用課題組前期篩選出的最優(yōu)提取工藝，即取黃柏600 g、蛇床子300 g，粉碎至粗粉，混勻，加24倍80%乙醇浸漬8 h后以2 mL/min體積流量進行滲漉提取，收集提取液，回收乙醇，水浴蒸發(fā)至稠膏狀，進行減壓干燥，即得。

2.2 色譜條件 Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-[乙腈-0.1%磷酸(每100 mL含0.2 g SDS)](B)(15∶85)，梯度洗脫(0～18 min，27%～29%A；18～23 min，29%～37%A；23～40 min，37%～38%A；40～60 min，38%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm(歐前胡素)、230 nm(鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿)、322 nm(蛇床子素)；進樣量5 μL。

2.3 凝膠劑基質選擇 表1顯示，卡波姆效果最理想，但由于黃柏提取物主要成分為生物堿，與其混合后黏度急劇降低，產生不可溶性沉淀，導致藥物難于分散均勻，不宜作為基質；CMC-Na、HPMC也均可形成均勻細膩的凝膠，但其在黏性、流變性方面未達到凝膠基質要求，故將兩者混用以改善上述問題。

表1 不同基質考察結果

2.4 單因素試驗

2.4.1 HPMC用量 每10 g凝膠中固定黃柏-蛇床子提取物用量0.5 g，pH 7，甘油用量1 g，CMC-Na用量0.1 g，設定HPMC用量為2%、3%、4%、5%、6%，結果見表2。由此可知，當HPMC用量大于5%時，凝膠整體黏稠度較大，較難涂布，也難以將藥物均勻覆蓋至皮膚表面；當用量小于3%時，凝膠成型性較差，黏稠度較低，導致藥物在皮膚附著性較差；當用量在3%～5%范圍內時，凝膠外觀光滑均勻細膩，黏稠度適中，成型性好，易于涂布，故選擇3%～5%作下一步考察。

表2 HPMC用量篩選結果

2.4.2 甘油用量 每10 g凝膠中固定黃柏-蛇床子提取物用量0.5 g，pH 7，HPMC 0.4 g，CMC-Na 0.1 g，設定甘油用量為0、5%、10%、15%、20%，結果見表3。由此可知，當不加入甘油時，凝膠黏度較低，皮膚附著性較差；當用量達到20%時，凝膠黏稠度較大，不易涂展；用量在5%～15%范圍內時，黏度適中，涂展性較好，故選擇5%～15%作下一步考察。

表3 甘油用量篩選結果

2.4.3 載藥量 每10 g凝膠中固定HPMC 用量0.4 g，CMC-Na用量 0.1 g，pH 7，甘油用量1 g，設定載藥量為3%、5%、7%、9%、11%，結果見表4。由此可知，當載藥量在3%～7%范圍內時，凝膠成型性較好，黏稠度適中，容易涂展；當載藥量達到9%后，凝膠質地不均，出現(xiàn)結塊現(xiàn)象，成型性較差，黏稠度較大，不易涂展；當載藥量達到11%時，凝膠稠度過大，難以混合均勻，藥物結塊不能分散，故選擇3%～7%作下一步考察。

表4 載藥量篩選結果

2.5 Box-Behnken響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇HPMC用量(A)、甘油用量(B)、載藥量(C)作為影響因素，綜合評分作為評價指標，計算公式為綜合評分Y=(制劑得分/最大值)×0.5+(體外釋放度/最大值)×0.5，其中制劑得分=外觀性狀×0.4+黏稠度×0.3+涂展性×0.3，滿分為100分，采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化處方，評分標準見表5，因素水平見表6，結果見表7，Box-Behnken設計響應曲面擬合結果見表8。

表5 制劑評分標準

表6 因素水平

響應面分析見圖1。由此可知，HPMC用量與甘油用量、HPMC用量與載藥量、甘油用量與載藥量的3D曲線均較陡，等高線均趨于橢圓，表明三者之間交互作用顯著，與表8一致。通過Design-Expert 8.0.6軟件，最終得到最優(yōu)處方為HPMC用量3.93%，CMC-Na用量1%，甘油用量10.17%，載藥量4.74%，pH 7，考慮到實際操作的便捷性，將其修正為HPMC用量4%，CMC-Na用量1%，甘油用量10%，載藥量5%，pH 7。

表7 試驗設計與結果

表8 方差分析

圖1 各因素響應面圖

2.6 驗證試驗 按上述優(yōu)化工藝制備5批凝膠，進行驗證試驗，結果見表9，可知該工藝穩(wěn)定可行。

2.7 體外釋放度測定

2.7.1 線性關系考察 精密稱取鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿、歐前胡素、蛇床子素對照品2.82、28.65、2.42、4.07 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，精密吸取1、3、5、7、9 mL至20 mL量瓶中，甲醇定容至刻度。以質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行回歸，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見表10，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.7.2 提取物含量測定 精密稱取“2.1”項下提取物0.1 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算含量。結果，每1 g提取物含鹽酸黃柏堿18.094 6 mg、鹽酸小檗堿154.244 9 mg、歐前胡素9.951 8 mg、蛇床子素26.194 1 mg。

表9 驗證試驗結果(n=5)

表10 各成分線性關系

2.7.3 測定方法 參照2015年版《中國藥典》四部第三法[13]，精密稱取蛇黃凝膠1 g，置于透析袋(截留相對分子質量3 500)中，以含20%乙醇的生理鹽水200 mL為接收液，將透析袋置于擴散池中，在溫度(37±0.5) ℃、轉速100 r/min條件下于1、2、4、6、8、10、12 h取接收液各5 mL，同時補充等溫度、等體積的接收液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算各成分在不同時間點的累積釋放度。

2.8 穩(wěn)定性考察

2.8.1 耐高溫試驗 取5批蛇黃凝膠，在60 ℃下恒溫加熱12 h后取出，靜置至室溫，發(fā)現(xiàn)該制劑外觀性狀無明顯變化，質地均勻細膩，黏稠度適中無變稀現(xiàn)象，易于涂布，表明其耐熱性良好。

2.8.2 耐寒試驗 取5批蛇黃凝膠適量，在-20 ℃下冷藏24 h后取出，靜置至室溫，發(fā)現(xiàn)該制劑外觀性狀無明顯變化，也無分層、變稀現(xiàn)象，易于涂布，表明其耐寒性良好。

2.8.3 離心試驗 取5批蛇黃凝膠，置于離心管中，4 500 r/min離心20 min，發(fā)現(xiàn)該制劑外觀性狀均勻，無分層、變稀現(xiàn)象，涂展性良好，表明其離心穩(wěn)定性良好。

3 討論

在藥物處方篩選優(yōu)化過程中，所用方法主要包括正交設計、均勻設計、Box-Behnken響應面法等，其中正交設計、均勻設計存在試驗精密度較低、模型預測性較差等問題；Box-Behnken響應面法基于非線性模式進行研究，可確定在試驗范圍內任何試驗點的預測值，具有試驗次數(shù)少、精密度和結果可信度高、預測性好等優(yōu)點[14-16]。本實驗以制劑外觀性狀、體外釋放度為評價指標，通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化蛇黃凝膠劑處方工藝，并進行驗證試驗，發(fā)現(xiàn)該工藝合理可行，穩(wěn)定易控。

生物堿類成分易與卡波姆發(fā)生反應，從而導致凝膠黏度降低，產生不溶性沉淀。pH雖對基質黏度有較大影響，但本實驗控制pH在卡波姆較為適宜成型的范圍內依然無法成型，其原因可能是黃柏中主要提取出的生物堿為鹽酸小檗堿，屬季胺堿、強電解質，而離子濃度可影響整個凝膠系統(tǒng)的流變學行為，導致黏度降低。

課題組前期在藥材成分含量測定中發(fā)現(xiàn)，酸性條件會導致蛇床子中有效成分歐前胡素發(fā)生結構轉化，生成花椒毒素，后者雖具有一定抗炎抗菌作用，但其結構中的酚羥基在空氣中易氧化為無效物質[17]。綜合考慮制劑成型性、對藥效成分保護作用、使用時對皮膚保護作用，最終擬定pH為7。

目前，市面上常用的中藥凝膠劑較少，這與中藥處方藥味眾多、成分復雜、輔料選擇有限有一定關系。在后續(xù)中藥凝膠劑的開發(fā)過程中，一方面應重點關注藥效物質指認、提取、分離純化；另一方面，應致力于新輔料研發(fā)，平衡藥物與輔料、生物體之間的相容性，從而為相關研究提供新思路。