Nrf2在黃芩素抑制氧化應激誘導心肌細胞凋亡中的作用

徐由財， 丁文俊， 陳 思， 陳俊邦， 陳婷芳， 曾科峰， 劉 彬,2*， 張競之,2*

(1.廣州醫科大學附屬第二醫院中醫科，廣東 廣州 510260；2.廣州醫科大學中西醫結合研究所，廣東 廣州 510180)

心血管疾病是世界人口死亡的主要原因[1]，在我國發病率也逐年上升，其中缺血性心臟病是最受關注的問題之一[2]。氧化應激引起的心肌細胞損傷是缺血性心臟病發生的重要環節，它可引起動脈粥樣硬化、心肌缺血、缺血再灌注損傷等[3]，因此緩解心肌細胞氧化損傷和凋亡是防治缺血性心臟病的重要策略。

核因子E2相關因子(nuclear factor E2 related factor, Nrf2)是細胞抗氧化應激的關鍵轉錄因子[4]，在一般情況下，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)會通過泛素化降解來抑制Nrf2的轉錄活性；在氧化應激條件下，Keap1的特定半胱氨酸殘基被修飾，失去了泛素化降解Nrf2的能力，使其在細胞內積累并轉移入核，誘導血紅素氧合酶1(Heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]等下游靶基因的表達。Nrf2信號通路在保護心肌細胞方面起著重要作用[5]，其過表達能使小鼠維持氧化還原穩態，抑制氧化應激及心室重構[6]。

黃芩素是中藥黃芩中活性最高的黃酮類化合物之一，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效[7-8]，Zhao等[9]發現，該成分能調節Ca2+水平影響蛋白的激活和表達，改善心功能及抑制細胞凋亡，但其心肌保護作用和潛在機制尚未明確。因此，本研究考察黃芩素抗氧化損傷、抗凋亡的作用及Nrf2信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 黃芩素對照品(批號MUST-19101105)購自成都曼思特生物科技有限公司。二甲基亞砜(DMSO，批號RNBK1113)、叔丁基過氧化氫(TBHP，批號BCCB8820)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS，批號2029091)購自以色列Biological Industrie公司；DMEM培養基(批號8120120)、PBS(批號8120122)、胰蛋白酶(批號2072818)均購自美國Gibco公司；Nrf2抗體(貨號12721)、IgG二抗(貨號7074)購自美國CST公司；HO-1(貨號AF5393)、NQO1(貨號DF6437)、Bcl-2(貨號AF6139)、Bax(貨號AF0120)、β-actin(貨號AF7018)抗體購自美國Affinity公司；SOD試劑盒(批號20201015)、GSH-Px試劑盒(批號20201014)購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒(批號UJ292597)購自美國Thermo公司；MTS試劑(批號0000453287)購自美國Promega公司；TUNEL凋亡試劑盒(批號BZ2006024)購自武漢塞維爾生物科技有限公司；ML385抑制劑(批號S879001)購自美國Selleck公司。

1.2 細胞培養 H9c2細胞購自中國科學院上海細胞庫，用含10% FBS、青霉素 (100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，當呈80%～90%融合時以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每2～3 d傳代1次。

1.3 分組 本研究采用TBHP構造H9c2細胞氧化損傷模型，探討黃芩素抑制TBHP誘導的H9c2細胞凋亡及氧化損傷時，分為對照組、模型組和黃芩素2.5、5、10 μmol/L組；探討黃芩素能否直接激活Nrf2通路時，分為對照組和黃芩素2.5、5、10 μmol/L組；探討ML385能否抑制黃芩素激活Nrf2信號通路時，分為對照組、模型組、黃芩素組(10 μmol/L黃芩素)、ML385組、黃芩素+ML385組(10 μmol/L黃芩素+20 μmol/L ML385)。

1.4 MTS法檢測細胞活力 調整細胞密度至5×104/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養箱中培養24 h后加入含不同濃度待測藥物的培養基，每孔100 μL，每組設4個復孔，放入培養箱培養12 h后造模2 h，棄舊培養基，每孔加入100 μL含MTS的工作液(DMEM∶MTS=5∶1)，37 ℃恒溫箱內避光孵育2 h，采用酶標儀在490 nm波長處檢測光密度(OD)值，并計算細胞存活率。

1.5 分子對接及分子動力學 采用Autodock Vina軟件[10]進行分子對接，分析Keap1(PDB ID：6QMC)與黃芩素(PubChem CID: 5281605)之間的結合相互作用。在分子對接前，去除原始空間結構中的水和配體來制備Nrf2的分子對接模擬蛋白，采用YASARA軟件[11]進行分子動力學模擬。

1.6 表面等離子共振(SPR) 使用PlexArray HT系統進行表面等離子共振篩選以確定黃芩素和Keap1的結合，將Nrf2蛋白打印在3D傳感芯片上，并通過光穿越反應將其固定，為獲得結合親和力，至少需要設置3個不同濃度。通過在25 ℃下以2 μL/s的體積流量流經樣品進行300 s締合，然后在運行緩沖液中進行300 s的解離，再以3 μL/s的體積流量運行200 s的再生緩沖液，可獲得典型的結合曲線。

1.7 試劑盒檢測細胞SOD、GSH-Px活性 將H9c2細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板，每組設3個復孔，待細胞長至80%～90%時分別給予不同濃度的藥物預處理12 h，TBHP處理2 h，收集細胞，超聲裂解，離心后取上清液，按照相關檢測試劑盒說明書檢測細胞SOD、GSH-Px活性。

1.8 TUNEL法檢測細胞凋亡率 按“1.7”項下方法收集細胞，根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察，計算凋亡率。

1.9 Western blot檢測相關蛋白表達 按“1.7”項下方法收集細胞，PBS漂洗后用適量RIPA裂解液裂解15 min，刮取蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，在100 ℃下加熱10 min，12% SDS-PAGE進行電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次7 min，加入二抗37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，每次7 min，ECL化學發光試劑盒顯色，掃描膜，采用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與β-actin比值作為待測目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 黃芩素抑制TBHP誘導的H9c2細胞凋亡 如圖1A所示，在0～600 μmol/L TBHP濃度范圍內的細胞存活率隨著濃度增加逐漸降低(P<0.01)；與對照組比較，在TBHP濃度為200 μmol/L時，H9c2細胞存活率約為75%，故后續選取該濃度誘導H9c2細胞氧化損傷。如圖1B所示，與對照組比較，模型組細胞存活率降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芩素預處理后細胞存活率提高并呈劑量依賴性(P<0.01)。如圖1C～1D所示，與對照組比較，模型組H9c2細胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芩素預處理后細胞凋亡率降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。如圖1E～1F所示，與模型組比較，黃芩素2.5 μmol/L組細胞Bcl-2/Bax比值表達無明顯變化(P>0.05),而5、10 μmol/L組細胞Bcl-2/Bax比值表達升高，并呈劑量依賴性(P<0.01)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖1 黃芩素抑制TBHP誘導的H9c2細胞凋亡Fig.1 Inhibitory effects of baicalein on TBHP-induced H9c2 cell apoptosis

2.2 黃芩素抑制TBHP誘導的細胞氧化應激 如圖2所示，與對照組比較，模型組細胞上清液SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，黃芩素2.5 μmol/L組細胞SOD、GSH-Px活性無明顯變化(P>0.05)，5、10 μmol/L組細胞SOD、GSH-Px活性升高，并呈劑量依賴性 (P<0.01)。

注：A～B分別為SOD、GSH-Px活性。與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖2 黃芩素抑制TBHP誘導的氧化應激Fig.2 Inhibitory effects of baicalein on TBHP-induced oxidative stress

2.3 黃芩素與Keap1相互作用的分子模擬 本研究采用分子對接技術發現黃芩素能夠與Keap1的Kelch位點結合，結合力為-9.0 kcal/mol，其三維結構如圖3A所示，可知黃芩素與Keap1的氨基酸殘基ASN-414、ASN-382、ARG-415、SER-508形成氫鍵結合。通過分子動力學模擬進一步研究了Keap1與黃芩素復合物的穩定性，在0、100 ns時的表面可視化模型如圖3B所示，可知黃芩素能夠穩定的呈現在Keap1結合位點的中心，直到分子動力學模擬結束。在開始的35 ns內，Keap1蛋白的均方根偏差(RSMD)從0.5 ?增加到1.5 ?，并圍繞著1.25 ?波動(圖3C，藍色線)，而黃芩素的RMSD穩定在0.5 ?波動(圖3C，紅色線)，提示該成分與 Keap1結合是穩定的。

圖3 黃芩素與Keap1相互作用的分子模擬結果Fig.3 Results for molecular simulation of the interaction between baicalein and Keap1

2.4 黃芩素與Keap1相互作用的表面等離子共振分析 如圖4所示，黃芩素能與Keap1的Kelch位點直接結合，并且Keap1-黃芩素蛋白復合物能夠穩定存在，并可以劑量依賴性地方式快速結合Keap1，平衡解離常數(KD)值為6.54×10-7mol/L，表明該成分對Keap1具有很強的親和力，即與Keap1的Kelch位點結合較為穩定。

圖4 黃芩素與Keap1相互作用的表面等離子共振結果Fig.4 Results for surface plasmon resonance of the interaction between baicalein and Keap1

2.5 黃芩素激活Nrf2信號通路 如圖5所示，黃芩素能劑量依賴性地上調H9c2細胞內Nrf2的表達(P<0.01)；與對照組比較，黃芩素2.5 μmol/L組細胞HO-1、NQO1蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，5、10 μmol/L組細胞HO-1、NQO1蛋白表達升高，并呈劑量依賴性(P<0.01)。

注：A為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白條帶圖，B～D分別為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達統計圖。與對照組比較，##P<0.01。圖5 黃芩素激活Nrf2信號通路Fig.5 Activation of Nrf2 signal pathway by baicalein

2.6 ML385抑制黃芩素經Nrf2通路對心肌凋亡的保護作用 如圖6所示，與黃芩素組比較，黃芩素+ML385組細胞存活率降低(P<0.01)，細胞凋亡率、Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)，提示ML385能夠抑制黃芩素對心肌的保護作用。

2.7 ML385抑制黃芩素保護心肌免受氧化損傷的作用 如圖7所示，與黃芩素組比較，黃芩素+ML385組細胞SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達也降低(P<0.01)，說明ML385能夠抑制黃芩素保護H9c2細胞免受氧化損傷的作用。

注：A為細胞存活率，B為細胞凋亡TUNEL染色，C為細胞凋亡率，D為Bcl-2、Bax蛋白條帶圖，E為Bcl-2/Bax的相對表達統計圖。與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與黃芩素組比較，△△P<0.01。圖6 ML385抑制黃芩素對心肌的保護作用Fig.6 Inhibitory effects of ML385 to baicalein’s protection on cardiomyocytes

注：A～B分別為SOD、GSH-Px活性，C為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白條帶圖，D～F分別為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達統計圖。與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與黃芩素組比較，△△P<0.01。圖7 ML385抑制黃芩素的抗氧化作用Fig.7 Inhibitory effects of ML385 on baicalein’s antioxidation

3 討論

缺血性心臟病嚴重威脅人類生命健康，是人類死亡率及致殘率最高的疾病之一。氧化應激是缺血性心臟病的發病機制之一，當機體受到某些刺激時，細胞內生成大量活性氧(ROS)與活性氮(RNS)，一方面消耗抗氧化物質如SOD、GSH-Px等并生成有害物質如丙二醛(MDA)等，另一方面產生大量H2O2，并與金屬離子反應生成高活性的羥自由基，引發細胞鈣超載、蛋白質氧化、脂質過氧化，損害細胞膜完整性及功能，誘發細胞凋亡[12-13]。

黃芩素是中藥黃芩的活性成分之一，在抗癌、抗炎、神經發生、心臟保護等方面均有較好的作用。王家偉等[14]認為黃芩素可激活JAK-STAT信號通路對大鼠心肌細胞缺血再灌注起到保護作用；Chang等[15]發現黃芩素能通過Akt-NOS-NO信號通路清除ROS的爆發，進而對缺血再灌注的雞心肌細胞起保護作用。本研究發現黃芩素能提高TBHP誘導的H9c2細胞活力和SOD、GSH-Px活性，并減少細胞凋亡，具有良好的心肌保護作用。

在正常生理條件下，Nrf2基因表達的蛋白產物半衰期較短，緣于Keap1將Nrf2與E3泛素連接酶連接在一個復合物中，促進Nrf2蛋白的泛素化并通過26S蛋白酶體降解，這被認為是Nrf2負調控的典型機制[5]。Keap1是親電子試劑和ROS的生物傳感器，對細胞內Nrf2的調節起重要作用。Keap1主要具有BTB和 Kelch 兩個保守結構域，其中BTB和泛素連接酶結合，Kelch與Nrf2結合[16]。由于缺乏Nrf2與Keap1結合位點的蛋白結構，目前Nrf2激動劑的藥物研發都采用Keap1的Kelch位點虛擬篩選潛在的Nrf2激動劑。分子對接發現黃芩素能與Keap1的Kelch位點結合，結合力為-9.0 kcal/mol，并與Keap1的氨基酸殘基形成氫鍵；分子動力模擬發現黃芩素與 Keap1結合是穩定的，SPR發現黃芩素與Keap1結合的平衡解離常數(KD)為6.54×10-7mol/L。這些結果提示黃芩素能與Keap1的Kelch位點結合，且這種結合能穩定存在。

本研究結果顯示，黃芩素升高Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達，由此得出黃芩素可能是通過與Keap1的Kelch位點結合使Nrf2避免被泛素化降解，使其在細胞內迅速積累，轉移入核并誘導下游靶基因的表達。Nrf2信號通路在心肌保護方面愈發受到重視，Jiang等[17]發現BRG1可上調Nrf2和HO-1表達來減輕急性心梗時心肌細胞的氧化應激；Hu等[18]發現益氣活血方由Nrf2途徑在心力衰竭時起到心臟保護作用，使H9c2細胞免受OGD/R誘導的凋亡；Cui等[19]發現蝦青素經Nrf2信號通路對小鼠心臟氧化應激和赭曲霉毒素A暴露引起的線粒體凋亡起保護作用。本研究使用Nrf2抑制劑ML385后發現H9c2細胞活力和SOD、GSH-Px活性降低，細胞凋亡增加，說明ML385能抑制黃芩素對TBHP誘導心肌細胞凋亡的保護作用。

綜上所述，黃芩素可能通過激活Nrf2信號通路減輕了TBHP誘導H9c2引起的氧化應激損傷和細胞凋亡，從而發揮其心肌保護作用。本研究為黃岑素在臨床的運用提供了實驗依據。