一測多評法同時測定六味地黃丸中8種成分

李 艷， 侯媛芳， 伍永富， 談利紅， 穆禎強， 楊 林,4*

(1.重慶醫藥高等專科學校，重慶 401331；2.毒性中藥給藥系統重慶市重點實驗室，重慶 401331；3.太極集團重慶中藥二廠有限公司，重慶 402284；4.重慶市藥物制劑工程技術研究中心，重慶 401331)

六味地黃丸是滋陰補腎的經典名方，由熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉6味藥材組成，具有滋陰補腎的功效，用于治療腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、遺精盜汗。但國家藥品監督管理局發布公告(2021年第23號)[1]，指出六味地黃制劑有腹瀉、腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、胃腸不適、食欲不振、便秘、瘙癢、皮疹、頭痛、心悸、過敏等不良反應，要求藥品上市許可持有人應當對新增不良反應發生機制開展深入研究。

2020年版《中國藥典》一部對六味地黃丸的含量控制指標為莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚[2]，數量較少，難以全面準確地反映其質量；也有研究采用HPLC法同時測定六味地黃丸中多種有效成分含量[3-7]，但所需對照品數量多，耗費大，檢測成本昂貴。目前，一測多評法已在中藥制劑的質量控制中廣泛應用[8-12]，但鮮有用于六味地黃制劑，而且定量指標較少[13-14]。本實驗綜合考慮成分有效性[15-20]、可測性、對照品易得性等方面，采用一測多評法同時測定六味地黃丸中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚的含量，以期為該制劑質量評價提供參考，也為研究其不良反應機制奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA檢測器(美國Waters公司)；ME55電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；FA2204B電子天平(萬分之一，上海天美天平儀器有限公司)；800B多功能粉碎機(永康市速鋒工貿有限公司)；SB25-12DTN超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q integral-3超純水機(美國Merck Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸(批號110831-201605，純度90.8%)、5-羥甲基糠醛(批號111626-201912，純度99.2%)、莫諾苷(批號111998-201602，純度96.3%)、當藥苷(批號111742-200501，純度100%)、馬錢苷(批號111640-201808，純度99.0%)、芍藥苷(批號110736-201943，純度95.1%)、丹皮酚(批號110708-201407，純度99.9%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；山茱萸新苷對照品(批號19080905，純度98.0%)購自成都普菲德生物技術有限公司。六味地黃丸(濃縮丸)共21批，購自太極集團重慶中藥二廠有限公司，批號分別為1904086、1905103、1905109、1907154、1907155、1910224、2002033、2003039、2003040、2003041、2003042、2003043、2004062、2005069、2005071、2005075、2005076、2005078、2005079、2005080、2006086。甲醇、乙腈為色譜純，均購自成都市科隆化學品有限公司；磷酸為色譜純，購自重慶川東化工(集團)有限公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～8%A；5～20 min，8%A；20～35 min，8%～20%A；35～45 min，20%～60%A；45～55 min，60%A；55～56 min，60%～95%A；56～60 min，95%A；60～61 min，95%～5%A；61～66 min，5%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長240 nm；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

1.沒食子酸 2.5-羥甲基糠醛 3.莫諾苷 4.當藥苷 5.馬錢苷 6.芍藥苷 7.山茱萸新苷 8.丹皮酚1.gallic acid 2.5-hydroxymethyl-2-furaldehyde 3.morroniside 4.sweroside 5.loganin 6.paeoniflorin 7.cornuside 8.paeonol圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚對照品適量，70%甲醇溶解并稀釋成系列質量濃度，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，粉碎2 min，取粉末約1.65 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇約40 mL，超聲提取1 h，放冷，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 系統適用性與專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品溶液各20 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，在200～400 nm波長處進行全掃描，結果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖在對照品溶液色譜圖相應位置處有色譜峰，其光譜特征與對照品一致，峰純度檢測均符合要求(純度角度小于純度閾值)，分離度良好(均大于1.5)，理論塔板數均不低于3 000。

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下對照品溶液各20 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.6 相對校正因子計算 精密吸取“2.2”項下對照品溶液各20 μL，在“2.1”項色譜條件下進

表1 各成分線性關系

樣測定，以丹皮酚為內標，計算其他7種成分的相對校正因子fk/s，公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子

2.7 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚峰面積RSD分別為0.33%、0.30%、0.24%、0.25%、0.30%、0.32%、0.28%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗 取同一批本品(批號1905109)，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚含量RSD分別為0.93%、0.65%、0.62%、0.61%、0.95%、0.78%、0.55%、0.25%，表明該方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號1905109)，室溫下于0、4、8、12、18、24、36 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚峰面積RSD分別為0.44%、0.59%、0.34%、0.31%、0.22%、0.92%、0.49%、0.13%，表明溶液在36 h內穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品(批號1905109)粉末9份，每份約0.825 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，分成3組，每組3份，分別按80%、100%、120%水平精密加入對照品溶液(沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚質量濃度分別為1.539、0.890、1.501、0.416、1.302、0.686、0.302、1.077 mg/mL)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚平均加樣回收率分別為102.2%、100.9%、101.6%、99.0%、101.9%、100.8%、100.0%、102.1%，RSD分別為0.51%、1.3%、0.93%、1.2%、1.5%、1.7%、0.67%、0.82%。

2.11 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響 取“2.2”項下對照品溶液，考察Waters e2695、Agilent 1260 InfinityⅡ、Shimadzu Nexera X2色譜儀及Phenomenex Luna C18、Waters Sunfire C18、Wondasil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)對相對校正因子的影響，結果見表3，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.12 色譜峰定位 取“2.2”項下對照品溶液，以丹皮酚色譜峰為參照，計算其他7種成分相對保留時間，結果見表4，可知它們在不同儀器、色譜柱下穩定性良好(RSD<5%)。因此，本實驗采用相對保留時間進行色譜峰定位。

表4 各成分相對保留時間

2.13 樣品含量測定 取21批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法和一測多評法計算含量，再采用t檢驗進行統計學分析，結果見表5，可知2種方法所得結果無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 流動相采用乙腈-0.2%磷酸并進行梯度洗脫，相對于2020年版《中國藥典》中的乙腈-0.3%磷酸，降低了酸性，更有利于延長色譜柱使用壽命。再采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，發現各成分在240 nm波長處均有較大吸收，為了兼顧響應值，選擇該處作為檢測波長。

3.2 內標選擇 選擇內標時，應遵循性質穩定、價廉、易得、低毒、有效的原則。本實驗發現，丹皮酚含量高，性質穩定，無毒，對照品廉價并易得，色譜峰峰形最優，故選擇其作為內標。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實驗發現，50%甲醇、70%甲醇、甲醇加熱回流提取1 h時，70%甲醇提取效率最高，但低于超聲提取相同時間；3種溶劑超聲提取1 h時，甲醇超聲提取效率最低，而且莫諾苷、馬錢苷峰形差，出現拖尾、前沿分裂現象，無法滿足分析要求，其原因是甲醇與初始比例流動相(5%乙腈)極性相差過大而引起的溶劑效應，雖然50%、70%甲醇提取效率無顯著差異，但50%甲醇提取1 h后微孔濾膜過濾溶液困難，可操作性差。最終，選擇70%甲醇超聲提取1 h作為供試品溶液制備方法。

表5 各成分含量測定結果(mg/丸，n=2)

4 結論

本實驗采用一測多評法同時測定丹皮酚、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷的含量，該方法簡便準確，所得結果與外標法接近，可為該制劑全面科學的質量評價提供參考。