1 例貓細小病毒變異株的鑒定與分析

高 萌，孫曉笛

（杭州奧泰生物技術股份有限公司，浙江杭州310018）

貓細小病毒（feline parvovirus，FPV）又稱貓瘟病毒，屬于細小病毒科（Parvoviridae），是引起貓科動物病毒性腹瀉的常見病原體之一[1]。感染FPV 后，患貓表現為高熱、乏力、厭食、嘔吐、急性腹瀉和出血性腸炎等癥狀，白細胞數目大量減少，具有高發病率和高病死率[2]。貓細小病毒能夠通過患貓的糞便排泄物、嘔吐物和眼鼻分泌物等排出體外，也可通過體外寄生蟲傳播[3]。

1928 年，法國科學家首次發現FPV，后來又從貓、猴子、浣熊等多種動物身上成功分離出該病毒[4-6]。貓細小病毒蛋白（VP）基因易發生重組變異[7]。近年來，隨著病毒與宿主的共同進化，FPV出現變異現象。有研究利用宏基因組學對病毒進行分析，發現了新的細小病毒，導致細小病毒科的分類發生變化。根據國際病毒分類委員會（ICTV）的分類標準，細小病毒科目前被分為3個亞科：感染脊椎動物的細小病毒亞科（Parvovirinae）、感染無脊椎動物的濃核病毒亞科（Densovirinae）以及同時感染兩種動物的新亞科（Hamaparvovirinae）[8-11]。 其 中，屬 于 細 小 病 毒 亞 科（Parvovirinae）的FPV、濃核病毒亞科（Densovirinae）的博卡 病 毒（FBoV）和 新 亞 科（Hamaparvovirinae）的（Fechavirus）均可引起貓腹瀉和腸道感染，能夠與其他腸道病毒聯合感染導致更嚴重的臨床癥狀，如出血性腸炎[12-13]。FPV、FBoV 和Fechavirus 混合感染在腹瀉貓中也很常見。由于3種病毒具有相似的臨床癥狀和合并感染概率，在臨床診斷和流行病學調查中很難區分。為進一步了解FPV 的變異情況，本研究從各地收集貓病料糞便樣本，經FPV抗原檢測試紙和PCR檢測雙重驗證，測序并分析其序列遺傳進化情況，了解該變異株的分類地位，為后續對貓細小病毒鑒定和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源

貓糞便樣本采集于各地寵物醫院和診所，采用棉簽在貓的肛門采集病料，樣本進行編號，低溫保存和運輸。

1.1.2 試劑與儀器

主要試劑：FPV 抗原檢測試紙（杭州奧泰生物技術股份有限公司）；核酸提取試純化劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；Buffer、酶、50×TAE、DL 2000、Loading Buffer、GenRed（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；瓊脂糖（GENERAY）；氯化鈉（Solarbio）。

主要儀器：高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；電泳儀電源、水平電泳槽（北京六一生物科技有限公司）；紫外透射切膠臺（北京六一生物科技有限公司）；微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）；旋渦混合器（太倉市華利達實驗設備有限公司）；Real-Time PCR（Thermo Fisher Scientific）。

1.1.3 引物信息

引物信息見表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

CATACATGGCAAACAAATAGAGCA TGTTTTAAATGGCCCTTGTGTAGA AGAACCRCCRATCACARTCCACT TGGCRACCGCYAGCATTTCA GGTGCGACGACGGAAGATAT CAACACCACCATCTCCTGCT 237 465 332

1.2 試驗方法

1.2.1 FPV抗原試紙檢測

采用FPV 抗原檢測試紙，將貓糞便樣本（1Q～15Q）分別與緩沖液攪拌混勻，確保充分提取樣品。將測試板放置于平整干凈的桌面，取3滴樣品（約120 μL）垂直加入測試板上的樣品孔中，開始計時；5 min 后判讀結果，10 min 后結果無效。

1.2.2 病毒核酸提取

取適量糞便樣本，分別裝入1.5 mL 的離心管，加入500 μL 0.9%生理鹽水，充分振蕩混勻，12 000 r/min 離心2 min，取200 μL 上清液于新離心管。根據核酸提取純化試劑盒說明書進行操作，將提取的核酸置于-20 ℃保存。

1.2.3 PCR擴增

采用FPV、FBoV 和Fechavirus 引物對樣本DNA 進行PCR 擴增，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

PCR 反應體系（25 μL）：Buffer 5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板5 μL、酶2 μL、ddH2O 11 μL。

FPV-F/R 反應條件：94 ℃5 min；94 ℃45 s，51 ℃45 s，72 ℃30 s，35個循環；72 ℃10 min。

FBoV-F/R 反應條件：94 ℃5 min；94 ℃45 s，51 ℃45 s，72 ℃30 s，35個循環；72 ℃10 min。

FechavirusF1/R1 和F2/R1 反 應 條 件：95 ℃5 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環；72 ℃7 min，4 ℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序

取5 μL 擴增產物混合Loading Buffer 后加入1%瓊脂糖凝膠，在1×TAE緩沖液中進行電泳檢測，電泳條件為電壓180 V，時間30 min。在紫外透射儀中觀察結果，以DNA Marker DL2000為分子量標準，觀察記錄條帶位置和試驗數據，并保存電泳圖片。將正確擴增的產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.2.5 數據統計與分析

根據Genbank 中已公開的貓細小病毒序列信息，將所有序列經Blast 比對，采用BioEdit 軟件將序列全部調整為5'→3'。

利用MEGA 7.0 軟件，采用最大似然法（maximum likelihood algorithm，ML）同NCBI 中下載的序列構建進化樹；采用Kimura2-parameter 堿基替換模型，對所有對位排列結果中產生的空位（gaps）或缺失數據（missing data）選擇完全刪除（complete deletion）；進化樹每個分支的支持率采用bootstrap 方法計算，設定5 000 次重復[14]。若每個種的所有個體均聚為1 個單系分支，則認為該物種鑒定正確[15]。

2 結果與分析

2.1 FPV抗原試紙檢測結果（見表2）

利用FPV抗原檢測試紙，加樣后5 min進行結果判讀。由表2可知，1Q～14Q為陰性，15Q為陽性。

表2 FPV測試結果Tab.2 FPV test result

2.2 分子檢測鑒定

2.2.1 電泳檢測結果（見圖1））

分別采用FPV-F/R、FBoV-F/R、Fechavirus-F1/R1 和Fechavirus-F2/R1 引物對貓核酸樣本（1Q～15Q）進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

其中，FPV 片段大小約為237 bp，FBoV片段大小約為465 bp，Fechavirus-F1/R1 片 段 大 小 約 為332 bp，Fechavirus-F2/R1片段大小約為310 bp。將擴增長度正確的PCR產物進行基因測序。

由圖1 可知，FPV-14Q 和FPV-15Q 在FPV-F/R 引物的擴增下獲得了237 bp 左右的條帶，FPV-5Q 在Fechavirus-F1/R1 引物的擴增下獲得了332 bp 左右的條帶，符合目標片段位置。

因此，推測FPV-14Q 和FPV-15Q 為常規的貓細小病毒樣本，FPV-5Q為變異貓瘟Fechavirus樣本。

2.2.2 序列比對結果（見圖2）

為進一步驗證FPV-5Q 的膠體金層析和電泳檢測結果，將PCR產物送至華大基因公司測序。

根據測序結果，利用Chorme 軟件觀察峰圖是否存在套峰，并將合格的序列進行Blast和DNAMAN比對。

由 圖2 可 知，FPV-5Q 與NCBI 中MN396757.1（Fechavirus）的序列同源性達到100%。

2.2.3 ML進化樹（見圖3）

為更加直觀準確地鑒定FPV-5Q 樣本，基于FPV-5Q的Fechavirus-F1/R1 片段構建進化樹，以貓星狀病毒（FeAstV）為外群，同Genbank 中公布的序列（貓細小家族的FPV、FBoV 和FeBuV），利用最大似然法構建進化樹。由圖3 可知，FPV 和FeBuV 聚為同一分支，二者親緣關系更近，FboV 和Fechavirus 聚為同一支，獲得較高的自展支持率。其中，FPV-5Q 與兩個Fechavirus 在同一單系分支上，且置信度高達99%。因此，確定FPV-5Q 樣本中存在變異貓瘟Fechavirus。

3 討論

貓瘟是危害貓科動物的主要病毒性疾病之一。幼貓對該病極易感，且發病急、傳播快、病死率高，貓瘟對貓科動物的健康養殖和繁育具有極大的威脅[16]。FPV 在世界各地區廣泛分布流行，且由于病毒在不斷進化，FPV 出現變異。有研究陸續在貓身上發現新的細小病毒種類。因此，加強FPV 流行狀況及遺傳進化的分析，對減少該病的發生與流行具有重要的意義[17]。

與PCR檢測技術相比，膠體金檢測技術的應用更方便快捷，且應用廣泛。但PCR技術的敏感性遠高于膠體金檢測[4]。目前，在貓細小病毒病臨床診斷中仍以膠體金作為主要檢測方法。若貓正處于感染的潛伏期或是感染變異細小病毒，在檢測過程中可能存在假陰性，而PCR 均能夠有效檢測。因此,在臨床診斷中，若出現疑似FPV 感染且膠體金檢測結果為陰性時，建議采取PCR 檢測進一步驗證，以此確定是否患病動物感染變異細小病毒。

本研究對收集的貓糞便疑似樣本進行FPV 抗原檢測試紙檢測和PCR擴增檢測，FPV-5Q在試紙檢測中呈陰性結果，而在Fechavirus-F1/R1 引物的PCR 擴增中呈陽性，且與NCBI 中MN396757.1（Fechavirus）的序列進行比對，二者同源性達到100%。以FeAstV 為外群，利用最大似然法構建貓細小家族進化樹，FPV 和FeBuV 聚為同一分支，推測二者親緣關系更近，FBoV 和Fechavirus 聚為同一支，獲得較高的自展支持率。而FPV-5Q與兩個Fechavirus在同一單系分支上，遺傳距離更近，且置信度高達99%，確定FPV-5Q樣本中存在變異貓瘟Fechavirus。

目前尚無治療FPV的特效藥物，疫苗接種是唯一有效的防控措施。但對于新出現的貓細小病毒,也暫無有效疫苗可用[18]。新型細小病毒的出現給疫苗免疫工作帶來一定挑戰，醫護人員在貓胃腸道疾病的診斷工作中需要考慮到新病毒的存在，包括Fechavirus、FBoV 等[19]。為盡可能地限制病毒的傳播，應及時采取消毒和物理隔離等防控措施，在空間傳播上做到有力管控。因此，研制開發新型、快速、安全、高效的抗FPV的疫苗具有廣泛的應用前景[20]。

本研究對貓細小病毒變異株Fechavirus 進行了驗證，為及早預防和治療FPV 感染以及研制適合我國貓科動物的細小病毒變異疫苗株提供參考。

4 結論

本試驗利用FPV抗原試紙和PCR雙重驗證，證明我國感染貓科動物宿主的新型細小病毒Fechavirus 的存在，且PCR 技術在鑒別新型細小病毒的研究中具有更高的特異性。