痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴重程度及氣道重塑的相關性分析

何國慶，李斌

兒童哮喘已被證實為一種慢性氣道炎癥性疾病［1］。該病可導致患兒氣道反應性增加，臨床主要表現為長時間反復出現的咳嗽、喘息、氣促以及胸悶等癥狀，且在夜間或清晨癥狀有加劇現象［2］。近幾年兒童哮喘發病率持續上升。據相關數據顯示，2000 年以前我國兒童哮喘患病率約為0.91%，2000年以后已上升為1.60%，該病已嚴重影響患兒成長階段的身心健康［3］。患兒哮喘最重要的3 個病理改變為氣道炎癥、氣道重塑和平滑肌功能紊亂，其中氣道炎癥是患兒哮喘最基本的病理改變，也是氣道高反應和病情反復發生的重要因素之一［4］。這種氣道內炎癥會導致機體分泌大量的白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-25（IL-25）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子，直接損傷肺組織。這些炎癥因子可作為患兒哮喘的檢測指標［5］。人中性粒細胞防御素（HNP1-3）主要分布于人多形核中性粒細胞（PMN）中。相關研究發現，患兒哮喘時多種細胞都能夠表達HNP1-3；人軟骨糖蛋白-39（YKL-40）作為由多種細胞分泌的一種與炎癥相關的糖蛋白，多數學者認為其在免疫炎癥反應、刺激血管生成以及抗細胞凋亡等方面起到重要作用［6］。然而臨床上關于IL-25、HNP-13、YKL-40 表達水平與患兒哮喘嚴重程度的研究并不多見。本研究對比分析哮喘患兒痰中IL-25、HNP-13、YKL-40 表達水平與哮喘嚴重程度的關系以及與氣道重塑的相關性。報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2019 年1 月至2020 年6 月在海安市人民醫院就診的214 例急性哮喘患兒作為研究對象，根據《2014 年全球哮喘防治創議委員會兒童支氣管哮喘最新修訂指南》［7］，將所有患兒分為輕度組、中度組、重度組3 組。其中，輕度組58例，男37 例，女21 例，平均6～13 歲［（8.46±4.44）歲］；中度組91 例，男58 例，女33 例，年齡7～14 歲［（9.39 ± 5.62）歲］；重度組65 例，男38 例，女27例，年齡7～12 歲［（8.17 ± 4.12）歲］。同期選擇50例健康幼兒作為對照組，其中，男28 例，女22 例，年齡6～14 歲［（9.76±4.57）歲］。

1.2 納入及排除標準 患兒納入標準：（1）符合兒童支氣管哮喘診斷標準；（2）近1 個月無糖皮質激素治療史；（3）無其他過敏性疾病；（4）年齡≤14 歲；（5）患兒及其家長簽署本研究知情協議書。排除標準：（1）入院前2 周出現急性呼吸道感染；（2）合并支氣管擴張、肺間質性疾病等肺部其他疾病；（3）合并肝硬化、糖尿病以及嚴重臟器疾病；（4）無法配合研究者。對照組健康幼兒納入標準：（1）監護人均知情同意；（2）身體健康。排除標準：（1）有支氣管疾病家族史；（2）研究期間退出試驗者。各組幼兒一般資料經檢驗差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會審定批準。

1.3 治療方法 全部患兒入院后均進行規范治療，給予孟魯司特鈉等常規治療，治療期間根據患兒具體病情給予β2受體激動劑治療，合并感染患兒給予對應抗生素治療，1 周/療程，共4 個療程。

1.4 觀察指標 （1）肺功能指標檢測。采用德國耶格MasterScreen PFT System 型肺功能儀（德國耶格公司）檢測并比較患兒及受試者肺功能第1秒用力呼氣量（FEV1）、用力肺活量（FVC）及最大呼氣峰流速（PEF）。（2）痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 表達水平檢測。按照肖偉等［8］提供的誘導痰步驟，總誘導痰時間不超過30 min，于1 h 內將痰液稱重并加入5 倍0.1% 的二硫蘇糖醇，然后根據使用習慣反復吹打并置于搖床搖蕩5 min，隨后置于37℃恒溫箱培育15 min，培育完成后用無菌紗布過濾掉多余的黏液并置于離心管內，以3 000 r/min 離心10 min，取上層清液，-80℃下儲存待檢。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 表達水平，所用試劑由美國R＆D 公司提供，試劑均在有效期內，首先將特異性抗體與固相載體結合成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質，加受檢標本，保溫反應，形成固相抗原抗體復合物，再洗滌除去其他未結合物質，加酶標抗體，保溫反應，使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合，再次徹底洗滌未結合的酶標抗體；最后加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產物，利用酶標儀檢測其450 nm的波長，根據5 點定標的標準曲線計算其濃度，線性范圍為0.1～800.0 ng/ml，檢測下限為0.1 ng/ml。（3）氣道重塑情況評估。采用高分辨CT 評估氣道重塑情況，于主動脈弓上緣掃至肺尖，以右上葉尖段支氣管為觀察點，檢測支氣管管壁厚度（T）、管壁面積（WA）、支氣管管壁厚度與氣管外徑之比（WT%）、支氣管管壁橫截面積占支氣道總橫截面積的百分比（WA%）等指標，并分析與氣道重塑的相關性，數值越大代表氣道重塑越嚴重。本研究以WA%值作為氣道重塑程度指標。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件分析所得數據，全部數據均符合正態分布，計數資料組間構成比、率的比較采用卡方檢驗；計量資料2 組間均數比較采用t檢驗，2 組以上均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，對2 組計量資料間的相關性進行Pearson 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺功能指標和基底膜厚度比較 輕度組、中度組、重度組的FEV1、FVC、PEF 水平顯著低于對照組，而基底膜厚度大于對照組（P＜0.05），隨著病情加重輕度組、中度組、重度組的FEV1、FVC、PEF 水平顯著降低，基底膜厚度顯著增加（P＜0.05）。見表1。

表1 輕度組、中度組、重度組與對照組肺功能指標和基底膜厚度比較（±s）

表1 輕度組、中度組、重度組與對照組肺功能指標和基底膜厚度比較（±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與輕度組比較bP＜0.05，與中度組比較cP＜0.05。FEV1 為第1秒用力呼氣量，FVC 為用力肺活量，PEF 為最大呼氣峰流速

組別對照組輕度組中度組重度組F 值P 值例數50 58 91 65--FEV1（%）92.39±16.87 80.47±10.15a 70.22±11.40ab 59.99±8.93abc 32.990＜0.001 FVC（%）95.87±17.71 81.84±12.76a 72.19±10.07ab 61.87±9.62abc 38.793＜0.001 PEF（%）113.85±21.26 89.03±11.68a 82.00±11.31ab 70.56±8.41abc 45.872＜0.001基底膜厚度（μm）2.49±0.71 4.23±0.91a 5.30±1.23ab 6.49±1.42abc 36.856＜0.001

2.2 各組痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比較輕度組、中度組、重度組的IL-25、HNP1-3、YKL-40水平顯著高于對照組（P＜0.05），隨著病情加重輕度組、中度組、重度組的IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平顯著增高（P＜0.05）。見表2。

表2 輕度組、中度組、重度組與對照組痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比較（±s）

表2 輕度組、中度組、重度組與對照組痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比較（±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與輕度組比較bP＜0.05，與中度組比較cP＜0.05。IL-25 為白細胞介素-25，HNP1-3 為人中性粒細胞防御素，YKL-40 為人軟骨糖蛋白-39

組別對照組輕度組中度組重度組F 值P 值例數50 58 91 65--IL-25（pg/ml）162.57±21.46 285.63±25.72a 366.23±33.03ab 453.75±40.63abc 53.862＜0.001 HNP1-3（ng/ml）216.59±15.84 420.07±21.43a 498.98±37.92ab 579.03±41.26abc 44.839＜0.001 YKL-40（ng/ml）38.52±4.17 45.93±7.73a 54.06±9.94ab 68.99±11.01abc 48.694＜0.001

2.3 痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴重程度及氣道重塑程度相關性分析 分別以PEF%值、WA%值代表哮喘嚴重程度及氣道重塑程度，經Pearson 檢驗，痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴重程度及氣道重塑呈正相關。見表3。

表3 痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與哮喘嚴重程度及氣道重塑相關性分析

3 討論

哮喘3 個主要病理改變為氣道炎癥、氣道重塑和平滑肌功能紊亂，其中氣道炎癥是哮喘病理生理的基礎，可進一步導致氣道重塑和平滑肌功能障礙。在患兒氣道炎癥反應中，主要通過釋放一些顆粒蛋白及白三烯和血小板活化因子等細胞因子使支氣管收縮，從而導致氣道損傷、氣道反應性增加。患兒哮喘的臨床表現與氣道上皮結構密切相關，受損的上皮細胞不僅在氣道重塑過程中起到重要作用，還在修復狀態時分泌出多種細胞因子，如IL-25、白細胞介素-33（IL-33）等促進炎癥反應的進展。本研究中發現，患兒痰中IL-25 水平顯著高于健康對照組，并且隨著病情的加重其水平顯著增高。經Pearson 檢驗顯示，其與患兒哮喘嚴重程度和基底膜厚度呈正相關。而上皮基底膜增厚是患兒早期氣道重塑特征性病理變化，亦是氣道重塑的重要內容。分析原因可能為IL-25 通過誘導輔助型T 細胞2（Th2 細胞）產生白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）以及白細胞介素-13（IL-13）等因子。由此可見，通過對不同細胞產生不同的生物學效應促進了哮喘患兒的氣道炎癥反應。

有研究發現，部分患者在治療時盡管全身應用激素或白三烯調節，但哮喘炎癥細胞仍然繼續存在，其中以多形核白細胞（PMN）為多見，而HNP1-3主要分布在PMN 中，因此患兒哮喘時多種炎癥細胞均可表達HNP1-3［9］。本研究通過檢測對比各組之間HMP-13 水平，發現患兒痰中HMP-13 水平顯著高于健康對照組，并且隨著病情加重其水平顯著增高。經Pearson 檢驗顯示，其與患兒哮喘嚴重程度和基底膜厚度呈正相關。目前HNP1-3 在患兒哮喘中的具體病理機制尚不清楚。羅槑等［10］在研究中指出，HNP1-3 具有廣譜抗菌活性，但當其濃度過高時會有細胞毒作用，釋放到細胞外會引起組織損傷。趙勁波等［11］也在研究中指出，HNP1-3 可以介導上皮細胞釋放炎癥因子從而參與炎癥反應。因此，在患兒哮喘過程中，HNP1-3 可能介導氣道上皮細胞釋放出大量趨化因子，從而參與氣道炎癥反應，并形成惡性循環。

隨著對患兒哮喘的深入研究，炎癥因子YKL-40 被發現。YKL-40 可由多種細胞分泌，目前其生物學功能尚未完全闡明，但多數學者認為YKL-40在免疫炎癥反應、刺激血管生成以及抗細胞凋亡方面等起到重要作用［12］。本研究通過檢測對比各組之間YKL-40 水平，發現患兒痰中YKL-40 水平顯著高于健康對照組，并且隨著病情加重其水平顯著增高。經Pearson 檢驗顯示，其與患兒哮喘嚴重程度和基底膜厚度呈正相關，與王聰慧［13］的研究結果基本一致。YKL-40 在患兒哮喘中的具體病理機制尚不清楚，但Ilmarinen 等［14］在研究中指出，YKL-40 在炎癥反應中扮演了“哨兵”角色，其可以將嗜酸性粒細胞和T 細胞募集到感染部位，從而導致組織發生炎癥、免疫、重塑。因此，在患兒哮喘過程中，YKL-40 可能通過介導炎癥因子的表達分泌，參與患兒的免疫反應，調控微血管生成相關信號通路，促進了氣道炎癥反應的發生、發展。本研究中PEF%值、WA%值代表哮喘嚴重程度及氣道重塑程度，經Pearson 檢驗，痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴重程度及氣道重塑呈正相關。這可能是哮喘發作期間氣道內炎癥會分泌大量的IL-25，引起機體免疫反應，造成多形核白細胞分泌大量的HNP1-3；此外，哮喘發病期間機體會進一步分泌YKL-40 來刺激血管生成、抗細胞凋亡，達到緩解哮喘的目的。然而，劉保華［15］在哮喘的研究中未見YKL-40 水平與患者病情有相關性，與本研究結果不符，可能與劉保華等人在研究時給予患者糖皮質激素治療，從而影響了YKL-40 水平的表達有關。

本研究尚存在一定不足之處：（1）未能進一步對各指標基因、分子進行深入研究；（2）未能對各指標相關因子進行研究，如IL-4、IL-8；（3）未同時分析IL-25、HNP1-3、YKL-40 三者聯合檢測在診斷患兒哮喘嚴重程度及氣道重塑中的意義等。后續仍需更多的基礎研究進行驗證。