基于高通量測序的帶魚肌肉組織轉錄組微衛星信息分析

劉玉萍　王棋　黃新芯　徐開達　王忠明　高天翔　楊天燕

摘要：【目的】通過高通量測序平臺對帶魚肌肉組織進行轉錄組測序，從海量數據中查找微衛星（SSR）位點并進行生物信息學分析，為科學制定帶魚種質資源保護對策和管理措施提供參考依據。【方法】基于Illumina HiSeqTM 2500高通量測序平臺對采自浙江舟山近海的帶魚肌肉組織進行轉錄組測序，經FastQC和Trimmomatic進行數據質量評估和過濾后，使用Trinity組裝、去冗余得到Unigenes，再運用Micro-Satellite（MISA）挖掘SSR信息，并以Excel 2010計算SSR的數目、發生頻率、出現頻率、分布距離與密度、重復基元類別及重復區段長度等信息。【結果】帶魚肌肉組織轉錄組測序共獲得40424018條Raw reads，經Trinity從頭組裝獲得70113條Transcripts，去冗余后得到50482條Unigenes，其總長度為33886190 bp，平均長度為671.25 bp。使用MISA進行篩選，結果共發現18873個SSR位點，且這些SSR位點僅分布在其中的13082條Unigenes上，發生頻率為25.91%，出現頻率為37.39%。SSR按核苷酸重復類型進行分類，可分為單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復6種類型，以單核苷酸重復SSR數最多（10763個），出現頻率高達21.32%;帶魚肌肉組織轉錄組SSR中共檢測出173種重復基元，以四核苷酸重復基元種類最多（66種）、單核苷酸重復基元種類最少（4種）。單核苷酸重復中以A堿基的數量最多，有5167個（占48.09%）;二核苷酸重復基元以TG為主，有692個（占19.55%）;三核苷酸重復基元中以GAG為主，有206個（占10.08%）;四核苷酸重復基元出現頻率較高的有AAAC、ATGG、ATGT、CTGT、CTTT和TCCA，出現頻率均為3.64%;五核苷酸重復和六核苷酸重復的基元類型數量分布較均勻，無明顯優勢重復基元。SSR基元重復次數主要分布在5～6次和10～12次，共9864個，占SSR總數的52.27%。【結論】經高通量測序獲得的帶魚肌肉轉錄組SSR可用性高且具有較高的多態性潛能，在此基礎上可有針對性進行引物設計，為帶魚遺傳多樣性評價、遺傳結構分析及功能基因克隆等研究提供有效的分子標記，進而為其種質資源的保護與利用提供遺傳學數據資料。

關鍵詞： 帶魚;肌肉組織;微衛星（SSR）;轉錄組;高通量測序

中圖分類號： S917.4;S965.326? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0725-10

Bioinformatic analysis of microsatellite loci in the muscle transcriptome of Trichiurus lepturus based on

high-throughput sequencing

LIU Yu-ping WANG Qi HUANG Xin-xin XU Kai-da WANG Zhong-ming GAO Tian-xiang YANG Tian-yan

（1 Fisheries College， Zhejiang Ocean University， Zhoushan， Zhejiang? 316022， China; 2 Marine Fishery Research

Institute of Zhejiang Province， Zhoushan， Zhejiang? 316021， China）

Abstract：【Objective】Transcriptome sequencing of Trichiurus lepturus muscle tissue was carried out based on high-throughput sequencing platform. Microsatellite （SSR） loci were searched from massive data and bioinformatics analysis was conducted to provide references for germplasm resources protection and management of T. lepturus. 【Method】The Illumina HiSeqTM 2500 high-throughput sequencing platform was used to sequence the muscle transcriptome of T. lepturus collected from the coastal waters of Zhoushan， Zhejiang Province. The quality of high throughput sequencing data was evaluated and filtered by software FastQC and Trimmomatic. Unigenes were obtained through assembly and redundancy removal using software Trinity. Micro-Satellite （MISA） tool was performed to explore the SSR information. Excel 2010 was used to calculate the number， occurring frequency， appearing frequency， distribution distance and density， repeat motif and repeat length of SSR. 【Result】A total of 40424018 raw reads were generated from muscle transcriptome sequencing. About 70113 transcripts were obtained by de novo assembly using Trinity， and 50482 unigenes were retained after deduplication， with a total length of 33886190 bp and an average length of 671.25 bp. A total of 18873 SSR loci distributing among 13082 unigenes were screened by MISA， with the occurrence frequency of 25.91% and the occurrence frequency of 37.39%， respectively. SSR was classified according to the types of nucleotide repeats， which could be divided into six types：Mononucleotide repeat， dinucleotide repeat， trinucleotide repeat， tetranucleotide repeat， pentanucleotide repeat and hexanucleotide repeat. The number of mononucleotide repeat was the largest （10763）， with the occurrence frequency up to 21.32%. A total of 173 repeat motifs were detected， in which the number of tetranucleotide repeat motifs （66） was the largest and the number of mononucleotide repeat motifs （4） was the smallest. Among the mononucleotide repeats， the number of A was the largest （5167， 48.09%）; TG was the main dinucleotide repeat （692， 19.55%）; GAG was the main trinucleotide repeat （206， 10.08%）; AAAC， ATGG， ATGT， CTGT， CTTT and TCCA were the most frequent repeats with the same frequency of 3.64%. Pentanucleotide repeats and hexanucleotide repeats were evenly distributed， and no obvious dominant repeat motifs were observed. The number of repeat motifs （9864） was mainly distributed in 5-6 and 10-12 times， accounting for 52.27% of the total number of SSR. 【Conclusion】The SSRs obtained by high-throughput sequencing have higher availability and polymorphism potential. On this basis， researchers can targetedly design primers and provide effective molecular markers for the studies of genetic diversity evaluation， genetic structure analysis and functional genes cloning of T. lepturus， and then provide genetic data for further protection and utilization of its germplasm resources.FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

Key words： Trichiurus lepturus; muscle tissue; microsatellite （SSR）; transcriptome; high-throughput sequencing

Foundation items： Zhejiang Key Research and Development Project（2019C02056）; Zhoushan Science and Technology Project （2022C41022）; Open Foundation for Marine Sciences of Zhejiang Ocean University in the First-Class Subjects of Zhejiang （20180017）

0 引言

【研究意義】帶魚（Trichiurus lepturus）又稱刀魚或肥帶等，隸屬于鱸形目（Perciformes）帶魚科（Tri-chiuridae）帶魚屬（Trichiurus），生活在溫暖水域，我國的渤海、黃海、東海及南海海區均有分布，曾與曼氏無針烏賊（Sepiella maindroni）、大黃魚（Larimichthys crocea）和小黃魚（L. polyactis）并稱為四大海產，是我國單魚種產量最高的經濟魚類（嚴利平等，2005;林龍山等，2006;李發凱等，2016）。但自20世紀80年代以來，由于過度捕撈和產卵場環境遭到破壞，東海帶魚種群一度出現小型化、低齡化和低質化現象（徐漢祥等，1997;周永東等，2002）。近年來，隨著東海產卵帶魚保護區、東海帶魚國家級水產種質資源保護區和伏期休漁制度的建立，其資源衰退趨勢有所減緩，但整體形勢仍不容樂觀（杜萍等，2020）。因此，開展帶魚種質資源現狀及遺傳背景的調查研究，對于帶魚種群資源的恢復和開發管理具有重要意義。【前人研究進展】至今，國內外有關帶魚的研究主要集中在資源變動、漁業生物學及種群生態學等方面（徐漢祥等，2003;凌建忠等，2004;林龍山等，2006;陳云龍等，2013;金鑫等，2014）。關于帶魚遺傳多樣性和種群鑒別的常見技術手段有同工酶（王可玲等，1994;楊天燕和高天翔，2007）、隨機擴增DNA多態性（蒙子寧等，2003）、線粒體DNA（張繼民等，2009;鄭文娟等，2015;卞光明等，2017;吳仁協等，2019）及微衛星（Yang et al.，2007;An et al.，2010;畢金貞，2010）等。其中，微衛星DNA（Microsatellites DNA）又稱為簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR），是由1～6個核苷酸組成的串聯重復片段所構成，每個單元長度在1～10 bp，而單個微衛星DNA的總長度多在200 bp內（趙彥花等，2019;周康奇等，2020）。SSR分子標記廣泛分布于真核生物和少許原核生物基因組中，具有多態性豐富、穩定性良好、PCR擴增重復性高、雜合率高且遵循孟德爾遺傳定律呈共顯性遺傳等優點，已成為魚類種群遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜構建、增殖放流效果評估等研究領域的重要分子標記之一（何平，1998;朱濱和常劍波，1999;郭寶英等，2007）。近年來，隨著高通量測序技術的發展，基于轉錄組（RNA-Seq）數據大規模開發SSR分子標記的研究已十分成熟和便捷（肖韻錚等，2020;楊利艷等，2020）。Mikheyev等（2010）從斑蝶（Euphydryas editha）轉錄組中快速挖掘出大量SSR位點，有效解決了鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲從基因組中開發微衛星困難的問題。Yuan等（2014）對列入世界自然保護聯盟（IUCN）名錄中的瀕危物種棘腹蛙（Quasipaa boulengeri）進行轉錄組測序，成功分離獲得32個SSR位點，與采用傳統的富集文庫法開發SSR分子標記相比更便利。Hu等（2015）利用高通量測序技術從中國特有植物麻核桃（Juglans hopeiensis）的葉片、花蕾和果實組織轉錄組中開發出25對多態性SSR引物，并對2個地理種群的植株進行遺傳差異分析。Zhao等（2019）從我國北方常見淡水小型蝦類中華小長臂蝦（Palaemonetes sinensis）轉錄組中檢測出16對多態性SSR引物，進而對7個地理種群的319尾個體進行遺傳多樣性和遺傳結構研究。此外，章霞等（2019）對日本帶魚（T. japanicus）肝臟轉錄組SSR特征進行統計，并開發出10對可于今后多態性分析和驗證的SSR引物。【本研究切入點】傳統的SSR分子標記開發多采用生物信息法、鏈霉親和素磁珠富集法、硝酸纖維素膜雜交法等方式，其開發過程復雜、費時費力，且多態位點數量不多，能揭示的遺傳信息十分有限，難以滿足精準的種群遺傳結構分析和種質資源評估（賈小平等，2009）。因此，亟待通過高通量測序技術大量開發帶魚SSR分子標記，為其資源保護與利用提供遺傳學數據資料。【擬解決的關鍵問題】基于Illumina HiSeqTM 2500高通量測序平臺對采自浙江舟山近海的帶魚樣本肌肉組織進行轉錄組測序，從海量數據中查找SSR位點并進行生物信息學分析，以期為科學制定帶魚種質資源保護對策和管理措施提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

用于轉錄組測序的10尾帶魚樣品于2020年3月采自浙江近海的東海帶魚國家級水產種質資源保護區（東經123°15′，北緯30°10′）。剪取適量背部肌肉裝入含RNAhold保存液（北京全式金生物技術股份有限公司）的2 mL凍存管（美國Corning公司）中，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存。

1. 2 RNA提取及轉錄組測序

采用常規TRIzol法提取總RNA（美國Invitrogen公司），使用Agilent 2100（美國Agilent公司）和NanoDrop 2000（美國Thermo Fisher公司）檢測RNA濃度和純度。合格的RNA樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司構建cDNA混合文庫，然后基于Illumina HiSeqTM 2500平臺進行轉錄組測序。測序獲得的帶魚肌肉組織轉錄組Raw reads經FastQC和Trimmomatic進行質量評估和剪切，去除接頭、樣品標識序列、低質量的Reads及帶N堿基較多的Reads，以獲取高質量的Clean reads（Bolger et al.，2014）。FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

1. 3 數據拼接組裝及SSR位點篩選和統計

使用Trinity對Clean reads進行De nove組裝以獲得轉錄本（Transcript），參數設為“min_kmer_cov 2”，其余默認（Haas et al.，2013），去冗余后取每個轉錄本聚類中最長的轉錄本作為Unigenes用于后續分析。以Micro-Satellite（MISA）對帶魚Unigenes中潛在的SSR進行搜索（Beier et al.，2017），篩選條件參數設為：基元長度1～6 bp，單核苷酸重復次數不小于10次，二核苷酸重復次數大于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復次數至少5次。若2個SSR間的距離小于100 bp，則記為1個復合微衛星。使用Excel 2010統計并計算SSR的數目、發生頻率、出現頻率、分布距離與密度、重復基元類別及重復區段長度等信息。具體統計公式如下：

SSR發生頻率（%）=含SSR的Unigenes總數/Unigenes總數×100

SSR相對豐度（個/Mb）=篩選獲得的SSR總數/Unigenes總長度

SSR平均距離（bp）=Unigenes總長度/篩選獲得的SSR總數

SSR出現頻率（%）=檢測所得SSR總數/Unigenes總數×100

2 結果與分析

2. 1 轉錄組測序、拼接及組裝結果

基于Illumina HiSeqTM 2500平臺測序共獲得41886302條Raw reads，經質控后得到40424018條Raw reads，共計5643766129個核苷酸，平均為139.61 bp。GC含量為50.62%，N堿基數量為888823個，所占比例僅為0.02%。Q10、Q20和Q30分別為99.60%、98.15%和92.34%（表1），以上數據表明獲得的測序結果較好。

經Trinity從頭組裝獲得70113條Transcripts，去冗余后得到50482條Unigenes，總長度為33886190 bp，平均長度為671.25 bp。N50和N90（累加轉錄本長度為不小于總長50%或90%的拼接轉錄本長度）分別為1078和268 bp，其中最大長度為29197 bp、最小長度為201 bp。長度大于1000 bp的Unigens有8868條，占總Unigenes的17.57%;長度在500 bp以上的有18216條，占比36.08%（表2）。

2. 2 轉錄組SSR重復類型及其分布情況

使用MISA對總長33886190 bp的50482條Unigenes進行篩選，結果共發現18873個SSR位點，且這些SSR位點僅分布在其中的13082條Unigenes上，發生頻率為25.91%，出現頻率為37.39%。將這些SSR位點按核苷酸重復類型進行分類，可分為單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復6種類型。其中，以單核苷酸重復SSR數最多，有10763個，存在于8252條Unigenes上，出現頻率最高（21.32%）;然后依次是二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、六核苷酸重復和五核苷酸重復SSR，出現頻率分別為7.01%、4.05%、0.22%、0.04%和0.03%。SSR位點相對豐度排序為單核苷酸重復（317.62個/Mb）>二核苷酸重復（104.44個/Mb）>三核苷酸重復（60.32個/Mb）>四堿基重復（3.25個/Mb）>六核苷酸重復（0.59個/Mb）>五核苷酸重復（0.38個/Mb）;SSR平均長度以六核苷酸重復最長，為37.50 bp，然后依次為五核苷酸重復（34.60 bp）、四核苷酸重復（24.73 bp）、二核苷酸重復（20.55 bp）、三核苷酸重復（18.41 bp）和單核苷酸重復（13.14 bp）（表3）。此外，以復合形式存在的SSR位點有2384個，出現頻率為4.72%。

2. 3 轉錄組SSR重復基元類型

帶魚肌肉組織轉錄組SSR中共檢測出173種重復基元，其中以四核苷酸重復基元種類最多，有66種，然后依次為三核苷酸重復（58種）、六核苷酸重復（20種）、五核苷酸重復（13種）和二核苷酸重復（12種），單核苷酸重復因為受堿基數量的限制，重復基元種類最少（僅4種）。在66種四核苷酸重復基元類型中，數量和分布特征變化較小，SSR的優勢重復基元為AAAC、ATGG、ATGT、CTGT、CTTT和 TCCA等6種。在重復基元中，單核苷酸重復依舊在數量上占據絕對優勢，其中A、T堿基重復基元占單核苷酸重復SSR位點數量的94.50%;相對而言，五核苷酸重復和六核苷酸重復的基元類型與數量分布均較少。

從不同重復基元類型的含量（表4）來看，單核苷酸重復中以A堿基數量最多，有5167個（占48.09%），而C堿基數量最少，為251個（僅占2.33%）;二核苷酸重復基元以TG為主，有692個（占19.55%），其次是GT（19.02%）、AC（17.77%）和CA（15.91%）等3種重復基元，而CG和GC的數量分別只有4和5個;在三核苷酸重復基元中，所占比例最高的是GAG，有206個（占10.08%），其次是TCC（5.19%）、CAG（4.55%）、CCT（4.40%）和GGA（4.31%），而CGA的數量僅有2個（占0.10%）;四核苷酸重復基元出現頻率較高的有AAAC（3.63%）、ATGG（3.63%）、ATGT（3.63%）、CTGT（3.63%）和TCCA（3.64%）;五核苷酸重復和六核苷酸重復的基元類型數量分布較均勻，無明顯的優勢重復基元（圖1）。

在帶魚肉組織轉錄組SSR中，以10次重復的SSR數量最多，達3659個，占SSR總數的19.39%;其次是11、12、6和5次重復，SSR數量在1000～2300個，約占總SSR數目的52.27%。其中，單核苷酸重復次數分布在10～50次，主要集中在10～25次，占單核苷酸重復總數的97.71%;二核苷酸重復次數分布在6～42次，且主要集中在6～12次，共2887個，占該類型核苷酸重復總數的81.58%;三核苷酸重復次數分布在5～22次，其中2～8次重復占三核苷酸重復總數的93.74%;四核苷酸重復次數分布在5～24次，其中5～6次重復占四核苷酸重復總數的85.45%;五核苷酸重復、六核苷酸重復次數均在15次以內，以5～10次居多（表5）。FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

綜上所述，SSR基元重復次數主要分布在5～6次和10～12次，共9864個，占SSR總數的52.27%;其次是7～9次和13～20次，共5772個，占SSR總數30.58%;重復次數大于25次的SSR相對較少，主要由單核苷酸和二核苷酸重復基元組成，共342個，占SSR總數的1.81%，且單核苷酸和二核苷酸基元無重復5次的相關數據。此外，SSR基元重復次數增至10次后，隨著重復次數的增加SSR數量依次遞減，而單核苷酸重復所占的比例逐漸增加。

2. 4 轉錄組SSR長度分布及多態性評價結果

帶魚肌肉組織SSR序列長度區間跨度較大，范圍在10～96 bp。其中，六核苷酸重復SSR長度變化最小，在30～60 bp;二核苷酸重復SSR長度變化范圍最大，為12～84 bp。單核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復的SSR長度范圍分別為10～51 bp、15～66 bp、20～96 bp和25～65 bp。根據SSR長度可為兩大類：第一類是重復序列長度在20 bp及其以上的高度多態性I型，第二類是重復序列長度在12～20 bp的中度多態性II型（Wang et al.，2010）。本研究中，I型SSR僅2558條，約占SSR總數的18%;II型SSR共8663條，約占SSR總數的50%（圖2）。

3 討論

充分了解和掌握漁業對象的生物學特征和遺傳學背景，是開展漁業資源科學管理及可持續開發利用的前提（Ward，2020）。帶魚作為我國重要的海洋經濟魚類，線粒體和SSR分子標記仍是其種群遺傳學研究的主要手段。已報道的帶魚SSR分子標記篩選方法主要有鏈霉素磁珠捕獲法和富集文庫法，但這2種方法不僅耗時長、花費高，開發的SSR分子標記數量還十分有限。隨著高通量測序技術的發展和測序成本的降低，基于轉錄組學數據大量開發具有高多態性的帶魚SSR位點變得更加高效、便捷。本研究對采自浙江舟山近海的帶魚肌肉組織進行轉錄組高通量測序，使用SSR識別工具MISA在50482條Unigenes中搜索出18873個SSR位點，出現頻率為37.39%，與其他海洋魚類轉錄組中SSR的出現頻率相比，高于牙鲆（Paralichthys olivaceus，27.12%）（李超等，2015）、刀鱭（Coilia nasus，8.76%）（Fang et al.，2015）、銀鯧（Pampus argenteus，2.62%）（劉磊等，2016）和龍頭魚（Harpadon nehereus，18.99%）（黃新芯等，2021），但略低于黃姑魚（Nibea albiflora，39.30%）（龔詩琦等，2016），說明帶魚屬于轉錄組中SSR數量較豐富的魚類，帶魚轉錄組測序質量和SSR含量均處于較高水平，能為后續群體遺傳學研究提供充足的序列資源。相對于帶魚肝臟轉錄組測序數據中的發生頻率（40.95%）（章霞等，2019），本研究所得的數據略低，且與肝臟中單核苷酸重復～六核苷酸重復SSR的出現頻率（53.79%、30.63%、14.34%、1.12%、0.08%和0.03%）相比也偏低。此外，帶魚肝臟轉錄組SSR中單核苷酸和二核苷酸在重復次數分別達23和11次時突然增加，而在肌肉組織中單核苷酸重復～六核苷酸重復的出現次數隨著重復次數的增加依次遞減，并無突增現象，究其原因可能與選擇的組織不同有一定關系，但不排除測序平臺及檢索參數設置不同帶來的影響。

相對于序列長度長且重復性低的串聯重復單元，序列長度短且重復性高的串聯重復單元則表現出更高的突變率，其多態性比例也較高（Kelkar et al.，2008），但重復序列長度小于12 bp時SSR多態性反而降低，因此，長度在20 bp及其以上的I型SSR和長度在12～20 bp的II型SSR是可用性較高的潛在分子標記（Temnykh et al.，2001）。從核苷酸重復次數來看，本研究中帶魚肌肉組織SSR核苷酸重復次數在5～50次，剔除易發生錯配的單核苷酸重復類型，重復數最高可達50次。從SSR長度來看，重復長度在12～20 bp的SSR為2558個，重復長度大于20 bp的SSR有8663個，即超過75%的SSR具有中度及以上水平的多樣性。可見，帶魚肌肉轉錄組SSR可用性高且具有較高的多態性潛能，在此基礎上可有針對性進行引物設計，為帶魚的種質鑒定、遺傳差異檢測及功能基因定位等研究提供理論依據和實踐基礎。

二核苷酸重復是帶魚基因組SSR的主要類型（張浩冉等，2019），而本研究發現帶魚肌肉組織轉錄組中的SSR重復類型以單核苷酸重復為主。已有研究表明，二核苷酸重復類型的SSR主要位于非編碼區（虞杭等，2018）。由于簡化基因組測序是采取對基因組特定區域進行測序以反映物種全基因組信息的策略，能檢測到廣泛分布于編碼區、非編碼區和調控區的SSR位點信息，而真核生物在轉錄本RNA加工過程中會對內含子進行剪切，丟失部分非編碼區序列信息。因此，在依托轉錄組和基因組數據開發的SSR中其主導重復類型和重復數量存在一定差異。考慮到基因組信息有助于轉錄組注釋，而轉錄組數據也可對基因組序列進行補充和校正，在今后開展帶魚遺傳多樣性分析時可將這2種技術手段結合起來，為分子標記的挖掘和應用提供更全面的參考信息。Harr和Schl?tterer（2000）對黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）基因組SSR結構和組成的研究發現，復雜的多基元重復SSR出現頻率較高，通常暗示著物種進化水平較低或具有較低的變異頻率。在本研究中，帶魚肌肉組織轉錄組中低級重復基元（單核苷酸重復～三核苷酸重復）約占SSR總數的86.61%，出現頻率也較高（32.38%），而高級重復基元SSR的多態性相對較低，表明帶魚可能具有較長的進化歷史，且積累了較多的遺傳變異。

4 結論

經高通量測序獲得的帶魚肌肉轉錄組SSR可用性高且具有較高的多態性潛能，在此基礎上可有針對性進行引物設計，為帶魚遺傳多樣性評價、遺傳結構分析及功能基因克隆等研究提供有效的分子標記，進而為其種質資源的保護與利用提供遺傳學數據資料。FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

參考文獻：

畢金貞. 2010. 帶魚微衛星標記的開發和微衛星標記在牙鲆選擇育種中的應用[D]. 青島：中國海洋大學. [Bi J Z. 2010. The development of microsatellite markers from cutlassfish and the application of SSR in the selective bree-ding project of Japanese flounder[D]. Qingdao：Ocean University of China.] doi：10.7666/d.y1828271.

卞光明，王娜泠，胡則輝，王躍斌，胡成碩，柴學軍. 2017. 舟山帶魚線粒體COI基因SNP位點分析[J]. 浙江海洋學院學報（自然科學版），36（1）：19-24. [Bian G M，Wang N L，Hu Z H，Wang Y B，Hu C S，Chai X J. 2017. Analysis on mitochondrial COI gene SNP loci of Trichiurus lepturus from Zhoushan Sea Area[J]. Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），36（1）：19-24.]

陳云龍，單秀娟，戴芳群，金顯仕. 2013. 東海近海帶魚群體相對資源密度、空間分布及其產卵群體的結構特征[J]. 漁業科學進展，34（4）：8-15. [Chen Y L，Shan X J，Dai F Q，Jin X S. 2013. Relative stock density and distribution of hairtail Trichiurus lepturus and its spawning stock structure in coastal waters of the East China Sea[J]. Progress in Fishery Sciences，34（4）：8-15.] doi：10.3969/j.issn. 1000-7075.2013.04.002.

杜萍，陳全震，李尚魯，顏云榕，葉文建，俞存根. 2020. 東海帶魚資源變動及其棲息地驅動因子研究進展[J]. 廣東海洋大學學報，40（1）：126-132. [Du P，Chen Q Z，Li S L，Yan Y R，Ye W J，Yu C G. 2020. Advances in the Trichiu-rus lepturus changes and habitat driving factors in the East China Sea[J]. Journal of Guangdong Ocean University，40（1）：126-132.] doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2020.01. 017.

龔詩琦，王志勇，肖世俊，林愛強，謝仰杰. 2016. 黃姑魚轉錄組SSR的開發與驗證[J]. 集美大學學報（自然科學版），21（4）：241-246. [Gong S Q，Wang Z Y，Xiao S J，Lin A Q，Xie Y J. 2016. Development and verification of SSR based on transcriptome of yellow drum，Nibea albiflora[J]. Journal of Jimei University（Natural Science），21（4）：241-246.] doi：10.3969/j.issn.1007-7405.2016.04.001.

郭寶英，謝從新，熊冬梅. 2007. 微衛星DNA標記技術及其在魚類中的應用[J]. 水利漁業，27（4）：5-9. [Guo B Y，Xie C X，Xiong D M. 2007. mtDNA marking technique and their application in fishes[J]. Reservoir Fisheries，27（4）：5-9.]

何平. 1998. 真核生物中的微衛星及其應用[J]. 遺傳，20（4）：42-47. [He P. 1998. Abundance，polymorphism and applications of microsatellite in eukaryote[J]. Hereditas，20（4）：42-47.] doi：10.16288/j.yczz.1998.04.013.

黃新芯，蔣艷琳，蔣小姿，楊天燕. 2021. 基于高通量轉錄組測序技術的龍頭魚微衛星信息分析[J]. 浙江海洋學院學報（自然科學版），40（3）：189-197. [Huang X X，Jiang Y L，Jiang X Z，Yang T Y. 2021. Analysis of microsatellite markers in Harpadon nehereus based on transcriptome sequencing Illumina HiSeqTM 2500[J]. Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），40（3）：189-197.] doi：10.3969/j.issn.1008-830X.2021.03.001.

賈小平，王天宇，黎裕，宋燕春，石云素. 2009. 微衛星開發技術研究進展[J]. 安徽農業科學，37（24）：11439-11440. [Jia X P，Wang T Y，Li Y，Song C Y，Shi Y S. 2009. Research development of microsatellite exploitation techno-logies[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，37（24）：11439-11440.] doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2009.24.037.FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

金鑫，朱清澄，陳丙見，王曉杰，張衍棟，路偉. 2014. 緬甸外海大西洋帶魚基礎生物學特性初步研究[J]. 南方農業學報，45（1）：112-117. [Jin X，Zhu Q C，Chen B J，Wang X J，Zhang Y D，Lu W. 2014. Biological characteristics of Trichiurus lepturus in Andaman Sea of Myanmar[J]. Jour-nal of Southern Agriculture，45（1）：112-117.] doi：10.3969/ j：issn.2095-1191.2014.1.112.

李超，侯吉倫，王桂興，張曉彥，劉永富，童愛萍，劉海金. 2015. 基于牙鲆RNA-seq數據中SSR標記的信息分析[J]. 海洋漁業，37（2）：122-127. [Li C，Hou J L，Wang G X，Zhang X Y，Liu Y F，Tong A P，Liu H J. 2015. Bioinformatic analysis of SSR markers in transcriptomic sequencing Paralichthys olivaceus[J]. Marine Fisheries，37（2）：122-127.] doi：10.3969/j.issn.1004-2490.2015.02.004.

李發凱，田中榮次，巖田繁英，俞存根. 2016. 應用年齡結構產量模型評估東黃海帶魚資源[J]. 浙江海洋學院學報（自然科學版），35（2）：91-98. [Li F K，Tanaka E，Iwata S，Yu C G. 2016. Stock assessment of hairtail Trichiurus lepturus in the East China Sea and Yellow Sea using age structured production model[J]. Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），35（2）：91-98.] doi：10.3969/ j.issn.1008-830X.2016.02.001.

林龍山，張寒野，李惠玉，程家驊. 2006. 東海帶魚食性的季節變化[J]. 中國海洋大學學報（自然科學版），36（6）：932-936. [Lin L S，Zhang H Y，Li H Y，Cheng J H. 2006. Study on seasonal variation of feeding habit of hairtail （Trichiurus japonicus） in the East China Sea[J]. Periodical of Ocean University of China，36（6）：932-936.] doi：10.16441/j.cnki.hdxb.2006.06.017.

凌建忠，程家驊，任一平，林龍山. 2004. 東海帶魚主要體征與個體繁殖力的關系[J]. 中國水產科學，11（2）：116-120. [Ling J Z，Cheng J H，Ren Y P，Lin L S. 2004. Relationships between main physical characters and individual fecundities of hairtail Trichiurus japonicus in the East China Sea[J]. Journal of Fishery Sciences of China，11（2）：116-120.] doi：10.3321/j.issn：1005-8737.2004.02.006.

劉磊，彭士明，高權新，張晨捷，施兆鴻. 2016. 基于銀鯧RNA-seq數據中SSR標記的信息分析[J]. 安徽農業科學，44（28）：102-105. [Liu L，Peng S M，Gao Q X，Zhang C J，Shi Z H. 2016. Bioinformatic analysis of SSR markers based on RNA-seq of Pampus argenteus[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，44（28）：102-105.] doi：10. 3969/j.issn.0517-6611.2016.28.033.

蒙子寧，莊志猛，金顯仕，唐啟升，蘇永全. 2003. 黃海帶魚、小帶魚RAPD和線粒體16S rRNA基因序列變異分析[J]. 自然科學進展，13（11）：1170-1176. [Meng Z N，Zhuang Z M，Jin X S，Tang Q S，Su Y Q. 2003. Variation analyses of RAPD and mitochondrial 16S rRNA gene sequence of Trichiurus lepturus and Eupleurogrammus muticus in the Yellow Sea[J]. Progress in Natural Science，13（11）：1170-1176.] doi：10.3321/j.issn：1002-008X.2003.11.009.

王可玲，張培軍，劉蘭英，尤鋒，徐成，王建飛. 1994. 中國近海帶魚種群生化遺傳結構及其鑒別的研究[J]. 海洋學報，16（1）：93-104. [Wang K L，Zhang P J，Liu L Y，You F，Xu C，Wang J F. 1994. Study on population biochemical genetic structure and identification of hairtail （Trichiurus haumela Forskal） in the coastal waters of China[J]. Acta Oceanologica Sinica，16（1）：93-104.]FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

吳仁協，張浩冉，牛素芳，苗奔奔，翟云. 2019. 東海近岸帶魚（Trichiurus japonicus）線粒體控制區序列的群體遺傳變異研究[J]. 海洋與湖沼，50（6）：1318-1327. [Wu R X，Zhang H R，Niu S F，Miao B B，Zhai Y. 2019. Study on population genetic variation of Trichiurus japonicus in nearshore of the East China Sea in mitochondrial control region sequences[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，50（6）：1318-1327.] doi：10.11693/hyhz20190400077.

肖韻錚，韓世明，秦昭，李春奇. 2020. 滇黃精轉錄組測序及類黃酮合成相關基因的分析[J]. 河南農業大學學報，54（6）：931-940. [Xiao Y Z，Han S M，Qin Z，Li C Q. 2020. Analysis of transcriptome sequencing and related genes of flavonoids biosynthesis from Polygonatum kingianum[J]. Journal of Henan Agricultural University，54（6）：931-940.] doi：10.16445/j.cnki.1000-2340.2020.06.004.

徐漢祥，劉子藩，許源劍. 1997. 帶魚資源動態綜述及管理現狀分析[J]. 浙江水產學院學報，16（3）：53-59. [Xu H X，Liu Z F，Xu Y J. 1997. Comment on hairtail stock dynamic and discuss on management situation[J]. Journal of Zhejiang College of Fisheries，16（3）：53-59.]

徐漢祥，劉子藩，周永東. 2003. 東海帶魚生殖和補充特征的變動[J]. 水產學報，27（4）：322-327. [Xu H X，Liu Z F，Zhou Y D. 2003. Variation of Trichiurus haumela productivity and recruitment in the East China Sea[J]. Journal of Fisheries of China，27（4）：322-327.] doi：10.3321/j.issn：1000-0615.2003.04.006.

嚴利平，胡芬，李建生，劉勇，程家驊. 2005. 東海帶魚年齡與生長的研究[J]. 海洋漁業，27（2）：139-142. [Yan L P，Hu F，Li J S，Liu Y，Cheng J H. 2005. Age and growth of Trichiurus haumela in the East China Sea[J]. Marine Fisheries，27（2）：139-142.] doi：10.3969/j.issn.1004-2490. 2005.02.009.

楊利艷，張玉榮，楊雅舒，王美霞，陳保國，趙麗，張麗光，王創云. 2020. 基于RNA-seq數據分析玉米抗蟲響應基因的可變剪接事件[J]. 河南農業大學學報，54（2）：181-188. [Yang L Y，Zhang Y R，Yang Y S，Wang M X，Chen B G，Zhao L，Zhang L G，Wang C Y. 2020. Analysis of alternative splicing events of insect-resistant response genes based on RNA-seq data in Zea mays[J]. Journal of Henan Agricultural University，54（2）：181-188.] doi：10.16445/j.cnki.1000-2340.20200403.009.

楊天燕，高天翔. 2007. 黃海和東海帶魚群體同工酶分析[J]. 海洋水產研究，28（3）：44-49. [Yang T Y，Gao T X. 2007. Isozyme analyses of Trichiurus haumela in the Yellow Sea and East China Sea[J]. Marine Fisheries Research，28（3）：44-49.] doi：10.3969/j.issn.1000-7075.2007.03.007.

虞杭，張得芳，樊光輝，王占林. 2018. 枸杞轉錄組SSR分布特征分析及其與基因組SSR分布特征的比較[J]. 江蘇農業科學，46（14）：24-27. [Yu H，Zhang D F，Fan G H，Wang Z L. 2018. Characteristic analysis of transcriptome SSR distribution of Lycium barbarum and its comparison with genomic SSR distribution[J]. Jiangsu Agricultural Scien-ces，46（14）：24-27.] doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2018. 14.006.

張浩冉，梁鎮邦，吳仁協，牛素芳，柯宗宇，宿帥，韋歡，王權，孫貝. 2019. 利用SLAF-seq技術開發帶魚（Trichiurus japonicus）微衛星標記以及跨物種擴增檢測[J]. 基因組學與應用生物學，38（2）：574-585. [Zhang H R，Liang Z B，Wu R X，Niu S F，Ke Z Y，Su S，Wei H，Wang Q，Sun B. 2019. Development of microsatellite loci for hairtail （Trichiurus japonicus） by using SLAF-seq technology and cross-species amplification tests[J]. Genomics and Applied Biology，38（2）：574-585.] doi：10.13417/j.gab.038. 000574.FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

張繼民，劉霜，趙建民，馬兆黨，張洪亮. 2009. 帶魚（Trichiurus haumela）魚卵DNA的提取及其18S rDNA初步分析[J]. 海洋通報，28（6）：62-65. [Zhang J M，Liu S，Zhao J M，Ma Z D，Zhang H L. 2009. Preliminary study on DNA extraction and 18S rDNA of the Trichiurus haumela fish egg[J]. Marine Science Bulletin，28（6）：62-65.] doi：10.3969/j.issn.1001-6392.2009.06.011.

章霞，柳敏海，李凌剛，徐志進，李偉業，殷小龍，傅榮兵. 2019. 東海帶魚（Trichiurus japanicus）肝臟轉錄組SSR和SNP特征分析[J]. 漁業研究，41（4）：269-277. [Zhang X，Liu M H，Li L G，Xu Z J，Li W Y，Yin X L，Fu R B. 2019. SSR and SNP analysis based on Trichiurus japanicus transcriptome[J]. Journal of Fisheries Research，41（4）：269-277.] doi：10.14012/j.cnki.fjsc.2019.04.001.

趙彥花，區又君，溫久福，李加兒，周慧. 2019. 基于轉錄組測序技術的黃唇魚SSR分子標記篩選[J]. 南方農業學報，50（9）：2078-2087. [Zhao Y H，Ou Y J，Wen J F，Li J E，Zhou H. 2019. Development of SSR markers in Bahaba flavolabiata by transcriptome sequencing[J]. Journal of Southern Agriculture，50（9）：2078-2087.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.09.26.

鄭文娟，杜一超，林潔，蔣晨華，丁沃娜，朱世華. 2015. 基于線粒體DNA D-loop區部分序列分析舟山海域帶魚種群遺傳結構[J]. 水生生物學報，39（2）：408-413. [Zheng W J，Du Y C，Lin J，Jiang C H，Ding W N，Zhu S H. 2015. Genetic diversity analysis of Trichiurus lepturus in Zhoushan based on mitochondrial DNA D-loop region partial sequences[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，39（2）：408-413.] doi：10.7541/2015.53.

周康奇，潘賢輝，黃姻，覃俊奇，徐俊龍，杜雪松，文露婷，陳忠，潘志忠，鄧潛，林勇. 2020. 基于RNA-seq技術的奧利亞羅非魚轉錄組SSR位點信息分析[J]. 河南農業科學，49（11）：147-152. [Zhou K Q，Pan X H，Huang Y，Qin J Q，Xu J L，Du X S，Wen L T，Chen Z，Pan Z Z，Deng Q，Lin Y. 2020. Analysis of SSR site information in transcriptome of Oreochromis aurea based on RNA-seq[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，49（11）：147-152.] doi：10.15933/j.cnki.1004-3268.2020.11.019.

周永東，徐漢祥，劉子藩，薛利建. 2002. 東海帶魚群體結構變動的研究[J]. 浙江海洋學院學報（自然科學版），21（4）：314-320. [Zhou Y D，Xu H X，Liu Z F，Xue L J. 2002. A study on variation of stock structure of hairtall，Trichiurus haumela in the East China Sea[J]. Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），21（4）：314-320.] doi：10.3969/j.issn.1008-830X.2002.04.002.

朱濱，常劍波. 1999. 微衛星DNA及其在魚類中的應用[J]. 水生生物學報，23（6）：721-728. [Zhu B，Chang J B. 1999. Micosatellite DNA and its application in fishes[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，23（6）：721-728.]

An H S，Lee J H，Noh J K，Kim H C，Park C J，Min B H，Myeong J I. 2010. Ten new microsatellite markers in cutlassfish Trichiurus lepturus derived from an enriched geno-mic library[J]. Animal Cells and Systems，14（3）：169-174. doi：10.1080/19768354. 2010.504347.

Beier S，Thiel T，Münch T，Scholz U，Mascher M. 2017. MISA-web：A web server for microsatellite prediction[J]. Bioinformatics，33（16）：2583-2585. doi：10.1093/bioinformatics/btx198.FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

Bolger A M，Lohse M，Usadel B. 2014. Trimmomatic：A flexible trimmer for Illumina sequence data[J]. Bioinforma-tics，30（15）：2114-2120. doi：10.1093/bioinformatics/btu 170.

Fang D A，Zhou Y F，Duan J R，Zhang M Y，Xu D P，Liu K，Xu P，Wei Q. 2015. Screening potential SSR markers of the anadromous fish Coilia nasus by de novo transcriptome analysis using Illumina sequencing[J]. Genetics and Molecular Research，14（4）：14181-14188. doi：10.4238/2015.November.13.1.

Haas B J，Papanicolaou A，Yassour M，Grabherr M，Blood P D，Bowden J，Couger M B，Eccles D，Li B，Lieber M，MacManes M D，Ott M，Orvis J，Pochet N，Strozzi F，Weeks N，Westerman R，William T，Dewey C N，Henschel R，LeDuc R D，Friedman N，Regev A. 2013. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis[J]. Nature Protocols，8（8）：1494-1512. doi：10.1038/nprot. 2013.084.

Harr B，Schl?tterer C. 2000. Long microsatellite alleles in Drosophila melanogaster have a downward mutation bias and short persistence times，which cause their genome-wide under representation[J]. Genetics，155（3）：1213-1220. doi：10.1093/genetics/155.3.1213.

Hu Y H，Zhao P，Zhang Q，Wang Y，Gao X X，Zhang T，Zhou H J，Dang M，Woeste K E. 2015. De novo assembly and characterization of transcriptome using Illumina sequen-cing and development of twenty five microsatellite mar-kers for an endemic tree Juglans hopeiensis Hu in China[J]. Biochemical Systematics and Ecology，63：201-211. doi：10.1016/j.bse. 2015.10.011.

Kelkar Y D，Tyekucheva S，Chiaromonte F，Makova K D. 2008. The genome-wide determinants of human and chimpanzee microsatellite evolution[J]. Genome Research，18：30-38. doi：10.1101/gr.7113408.

Mikheyev A S，Vo T，Wee B，Singer M C，Parmesan C. 2010. Rapid microsatellite isolation from a butterfly by de novo transcriptome sequencing：Performance and a comparison with AFLP-derived distances[J]. PLoS One，5（6）：e11212. doi：10.1371/journal.pone.0011212.

Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，Lipovich L，Cartinhour S，McCouch S. 2001. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice（Oryza sativa L.）：Frequency，length variation，transposon associations，and genetic marker potential[J]. Genome Research，11（8）：1441-1452. doi：10.1101/gr.184001.

Wang H，Iwai Jr T，Zhao B P，Lee C S，Yang J Z. 2010. Identification of microsatellite DNA markers for Pacific threadfin parentage assignment[J]. Journal of the World Aquaculture Society，41（1）：640-647. doi：10.1111/j.1749-7345.2010.00405.x.

Ward R D. 2000. Genetics in fisheries management[J]. Hydrobiologia，420（1）：191-201. doi：10.1023/A：100392832 7503.

Yang W T，Feng F，Yue G H. 2007. Isolation and characterization of microsatellites from a marine foodfish species ribbonfish Trichiurus haumela[J]. Molecular Ecology Resources，7（5）：781-783. doi：10.1111/j.1471-8286.2007. 01700.x.

Yuan S Q，Xia Y，Zheng Y C，Zeng X M. 2014. Development of microsatellite markers for the spiny-bellied frog Quasipaa boulengeri（Anura：Dicroglossidae） through transcriptome sequencing[J]. Conservation Genetics Resources，7（1）：229-231. doi：10.1007/s12686-014-0344-z.

Zhao Y Y，Zhu X C，Li Z，Xu W B，Dong J，Wei H，Li Y D，Li X D. 2019. Genetic diversity and structure of Chinese grass shrimp，Palaemonetes sinensis，inferred from transcriptome-derived microsatellite markers[J]. BMC Gene-tics，20（1）：75. doi：10.1186/s12863-019-0779-z.

（責任編輯 蘭宗寶）FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C