湖南岳陽豬沙門氏菌分離鑒定及耐藥性分析

彭娜娜，寧慧敏，王 文，鄧瑞德，董 偉

（湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128）

豬沙門氏菌病又稱為豬副傷寒，該病是由沙門氏菌引起仔豬的一類傳染性疾病。該病主要侵襲6月齡以下的仔豬，尤其對1～4月齡仔豬敏感；仔豬感染該疾病后，通常臨床上以急性、亞急性、慢性形式呈現[1]，主要表現為體溫升高、腹痛、下痢、呼吸困難，耳根、胸前和腹下皮膚有紫紅色出血斑，多以死亡告終[2]。該疾病一年四季均可發生，但在陰雨潮濕季節較為多發；主要傳染源為病豬和隱性帶病豬，此外還有攜帶病菌的人類或其它動物，可通過排泄物、飲水、日常管理使用的工具等傳播，主要經消化道感染該疾病[3]。豬沙門氏菌病對我國養豬業危害重大，威脅著人類食品安全及動物生命健康。

目前，隨著養殖場逐漸規?；?、集約化，生物安全防控措施的實施，以及疫苗的預防注射，因此豬場發生疫病的概率不斷下降；但是在豬類養殖過程中，由于沙門氏菌本身存在很強的抗藥性，加上抗生素濫用的現象比比皆是，導致沙門氏菌在豬類養殖場中層出不窮，誘發了大量疾病，嚴重威脅養殖業的安全。2021年5月，湖南岳陽某豬場部分仔豬發生腹瀉且糞便呈現灰綠色，筆者通過分析臨床癥狀及借助實驗室診斷技術，分離培養鑒定得到一株沙門氏菌，確定此病是由沙門氏菌感染所引起的，且在藥敏試驗結果中得知沙門氏菌對大部分大環內酯類、林可酰胺類抗生素有一定的耐藥性。本試驗對該疾病的防控提供了一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病死仔豬來源于湖南岳陽某豬場，通過剖檢病死仔豬，無菌采集肺臟、脾臟、肝臟以及腸系膜淋巴結，低溫送檢至湖南農業大學動物醫學院進行病原學診斷。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA抽提試劑盒、2×Taq master mix、DL 2 000 DNA Marker等試劑均購自于TakaRa公司；藥敏紙片購自于上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和果糖等購自于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養與革蘭氏染色鑒定 按照無菌操作的方法，用高溫灼燒后的手術刀將病變部位的組織切開，再用滅菌過后的接種環蘸取組織內部，接種至普通肉湯培養基中，37 ℃搖床培養12 h；待液體渾濁后，用滅菌后的接種環蘸取渾濁液體劃線于普通瓊脂培養基表面，37 ℃恒溫箱過夜培養；平板劃線得到單個菌落后，進行革蘭氏染色并進行純培養，以備后續的生化鑒定及細菌16S rRNA基因序列擴增。

1.2.2 生化鑒定 將分離的菌株接種于普通培養基進行培養，其后將單一菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等微量生化鑒定管，37 ℃培養48 h，統計并分析試驗結果。

1.2.3 分離菌株16S rRNA基因序列擴增及測序 根據參考文獻[4]合成用于PCR擴增細菌16S rRNA基因序列通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，并將該引物送至北京擎科生物科技有限公司長沙分公司合成。將分離純化好的菌液用DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，將其作為PCR擴增的模板，其PCR體系（50.0 μL）包括2×PCR Taqmaster mix 25μL、上下游引物各1 μL、DNA模板3 μL及雙蒸水20μL，并同時設置陽性對照和陰性對照，其模板分別為已知沙門氏菌DNA和雙蒸水；擴增條件為94℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后取8 μL產物進行凝膠電泳跑膠，將PCR陽性產物送至北京擎科生物科技有限公司長沙分公司雙向測序。

1.2.4 小鼠致病性試驗 將12只5周齡雄性昆明小鼠隨機分為2組，每組6只，其中試驗組小鼠腹腔注射分離菌原液0.2 mL/只，對照組小鼠腹腔注射等體積滅菌的生理鹽水。對各組小鼠攻毒后觀察其臨床癥狀等，并記錄相應的結果。

1.2.5 藥敏試驗 采用藥敏紙片擴散法對分離的致病菌進行藥敏試驗：將分離純化菌稀釋至1×108CFU/mL，取100 μL稀釋菌液均勻涂布于普通瓊脂培養基表面，取不同藥敏紙片貼于培養基表面，置于37 ℃恒溫培養24 h后測定不同藥敏紙片抑菌圈，根據該產品相關判定標準對結果進行分析。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定及生化試驗結果

無菌條件下接種至普通瓊脂培養基表面，37 ℃恒溫箱培養12 h后，可觀察到表面光滑且為圓形整齊的白色菌落；通過挑取單個菌落革蘭氏染色，發現菌體呈現兩端鈍圓的紅色短小桿菌，為革蘭氏陰性菌（圖1）。將單一菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等微量生化鑒定管，37 ℃培養48 h后，結果顯示葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、硫化氫試驗和MR試驗為陽性，乳糖、蔗糖、吲哚試驗、V-P試驗顯示均為陰性（表1）。此結果符合鼠傷寒沙門氏菌的生化特性。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢

表1 分離菌生化試驗結果

2.2 PCR擴增結果及序列分析結果

以分離純化后提取的細菌基因組DNA作為模板，通過細菌通用引物對其16S rDNA序列進行PCR擴增，凝膠電泳結果如圖2。該菌株16S rDNA基因序列PCR擴增產物大小約為1 600 bp，且陰性對照、陽性對照均成立。進一步測序結果分析得到該菌株16S rDNA基因序列與已知鼠傷寒沙門氏菌分離株（登錄號：CP070302）同源性最高，為99.87%；與其它細菌性病原對應序列同源性相對較低，因此推斷本試驗獲得的菌株屬于豬源鼠傷寒沙門氏菌。

圖2 分離菌株16S rDNA擴增PCR產物凝膠電泳結果

2.3 小鼠致病性試驗結果

為進一步分析該菌株的致病性，對試驗組與對照組昆明小鼠分別注射菌液與無菌生理鹽水，結果發現試驗組小鼠均出現體溫升高、走路不穩等不適癥狀，在接種的20 h內出現死亡，而對照組小鼠未出現異常情況。對死亡小鼠進行剖檢，取肝臟、腸道等臟器進行細菌分離培養鑒定，最終發現其革蘭氏染色特點與16S rDNA基因序列擴增及測序結果符合鼠傷寒沙門氏菌。

2.4 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果如表2所示，該試驗分離得到的菌株對頭孢曲松、羅紅霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟敏感，對氨芐西林、阿米卡星、頭孢噻吩、阿莫西林/克拉維酸、多西環素、新霉素中度敏感，而對克拉霉素、青霉素G、紅霉素、林可霉素、克林霉素耐藥。

表2 分離菌株耐藥性分析結果

3 討論

沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原菌和食源性病原菌，對養殖業和人類的健康危害巨大[5]，其發病形式通常會以散發性或地方流行性呈現，廣泛分布于自然界中，是在養殖過程中較為常見的傳染性疫病。沙門氏菌血清型分型是根據沙門氏菌菌體表面的抗原成分進行分型；沙門氏菌具有復雜的抗原結構，一般沙門氏菌具有菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原、表面（Vi）抗原和菌毛抗原4種抗原[6]。本試驗從湖南岳陽某豬場部分死亡仔豬的病理組織中分離出一株病原菌，我們通過細菌分離培養鑒定及16S rDNA基因序列擴增與分析得知該病原菌為鼠傷寒沙門氏菌；進一步探究沙門氏菌的致病性，結果顯示對小鼠具有一定程度的致病性。

目前，由于沙門氏菌本身存在一定的抗藥性，隨著養殖業的日新月異，人類濫用抗生素的現象屢教不改，因此導致沙門氏菌對于大多數抗生素敏感性較差。夏宇飛等[7]對湖南部分地區生豬養殖場、屠宰場的豬肛門拭子和雞盲腸樣本采樣進行沙門氏菌分離鑒定及耐藥性分析，結果顯示69株豬源和雞源沙門氏菌對四環素、氨芐西林、磺胺異唑的耐藥率在62%以上，對阿莫西林/克拉維酸、氟苯尼考的耐藥率在40%左右。王大春等[8]發現沙門氏菌分離株對頭孢菌素類和鏈霉素、環丙沙星較為敏感，但對四環素類、青霉素類和磺胺類藥物具有較高的耐藥性。本文所分離出來的菌株對頭孢菌素類、青霉素類、氟苯尼考等較為敏感，而對大部分大環內酯類、林可酰胺類抗生素耐藥，與夏宇飛等[7]和王大春等[8]研究結果略有差異，因此針對不同的分離菌株進行藥敏試驗分析是具有重大參考意義的，嚴格篩選合適的抗生素是進行防治的有效手段。