安徽某豬場豬鏈球菌9型的分離與鑒定

唐正露，王嘉珍，陳陽露，李 郁

（安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036）

豬鏈球菌（Streptococcus suis, SS）是世界范圍內引起豬鏈球菌病的最主要病原菌，可導致豬腦膜炎、心內膜炎、多發性漿膜炎、關節炎和敗血癥，還易與其他病原體造成混合感染[1]。根據莢膜多糖抗原性的不同，SS可分為35個血清型（1～34及1/2型），其中1/2、1、2、7、9和14型SS具有人畜共患性，以2型最為常見、致病力最強。在我國目前尚未見到SS9感染人的報道，但近年來SS9在獸醫臨床上的分離率逐漸上升且有擴大流行的趨勢。

2021年9—10月，安徽某豬場35～40日齡的斷奶仔豬臨床表現發熱、呼吸困難、神經癥狀，甚至急性死亡。本研究對送檢的發病豬病料進行細菌分離與鑒定，確定該場存在SS9感染，應用多位點序列分型（multilocus sequence typing, MLST）和PCR方法測定分離到的6株SS9的ST型和毒力基因型，同時構建系統發育樹以明確各分離菌株間的親緣關系及進化情況，從而為該場有效防控豬鏈球菌病提供依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為安徽某豬場送檢的6份疑似發生豬鏈球菌病的35～40日齡斷奶仔豬腦部。

1.2 主要試劑及培養基

2×Taq Mix Pro（+Dye）、DL 2 000 DNA Marker購自莫納（武漢）生物科技有限公司；胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）購自杭州微生物試劑有限公司；小牛血清購自上海羽哚生物科技有限公司；無菌脫纖維兔血購自南京茂捷微生物科技有限公司；革蘭氏染液購自南京建成生物工程研究所。

1.3 細菌分離培養與形態學觀察

無菌采集6份發病豬腦組織分別接種于含5%小牛血清的TSA-YE培養基和含5%兔血的TSA-YE培養基，采用需氧、微需氧、厭氧3種培養方式，置于37 ℃培養12～18 h，觀察細菌的生長情況，并挑取單個可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態特征。

1.4 引物合成

參考文獻[2-3]設計SS gdh基因、SS9分型基因cps9J、毒力基因（mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh）和管家基因（aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA）引物，均由通用生物系統（安徽）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 SSgdh基因、cps9J基因、毒力基因和管家基因引物信息

1.5 分離菌株的PCR鑒定

煮沸法提取6株分離菌基因組DNA作為模板，擴增SS gdh基因。PCR反應體系（25 μL）：2×Taq Mix Pro（+Dye） 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板5 μL。PCR反應條件：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35個循環；72 ℃、7 min。

1.6 SS血清型的PCR鑒定

煮沸法提取DNA模板，擴增cps9J基因。PCR反應體系（25 μL）：2×Taq Mix Pro（+Dye）12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板5 μL。PCR反應條件：95 ℃、15 min；94 ℃、30 s，58 ℃、90 s，72 ℃、1 min，30個循環；72 ℃、10 min。

1.7 SS毒力基因型PCR鑒定

煮沸法提取DNA模板，擴增6株SS9的毒力基因mrp、epf、sly、orf2、fbps和gapdh。PCR反應體系同1.5。PCR反應條件：95 ℃、5 min；94 ℃、1 min，56 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35個循環；72 ℃、10 min。

1.8 SS MLST鑒定及分析

1.8.1 6株SS9的ST型鑒定 參照安徽省地方標準DB 34/T 3488—2019鑒定SS MLST[4]，對6株SS9的7個管家基因進行擴增，擴增產物由通用生物系統（安徽）有限公司進行雙向測序。將測序結果上傳至SS MLST數據庫（http://ssuis.mlst.net）進行分析比對，獲得菌株相應管家基因等位基因編號，確定相應ST型。PCR反應體系同1.5。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火（退火溫度見表1）30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.8.2 系統發育樹的構建 利用Editseq軟件對1.8.1中測序結果進行序列的拼接比對，對齊序列利用MEGA 7軟件構建6株SS9分離株和7株SS9參考菌株[5-6]的ST型系統進化樹進行聚類分析。7株SS9參考菌株信息見表2。

表2 7株SS9參考菌株信息

2 結果

2.1 細菌分離培養及形態學觀察結果

從6份病料中共分離到6株細菌，分別命名為A～F。分離株在含5%小牛血清的TSA-YE均呈灰白色半透明、表面光滑、邊緣整齊針尖狀菌落；在含5%兔血的TSA-YE培養基均呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊小菌落，β溶血（厭氧培養時不溶血）；且在需氧、厭氧環境中培養時，細菌生長速度較微需氧培養時快；革蘭氏染色后鏡檢，分離株均為革蘭氏陽性菌，呈球形或卵圓形，鏈狀排列，符合SS的培養及形態學特性（圖1）。

圖1 分離株培養特性及形態學特性

2.2 分離菌株PCR鑒定結果

A～F分離株均擴增出SS gdh基因（688 bp），表明A～F分離株均為SS（圖2）。

圖2 A～F分離株SS的PCR鑒定結果

2.3 SS血清型PCR鑒定結果

A～F SS分離株均擴增出cps9J基因（368 bp），表明A～F SS分離株均為SS9（圖3）。

圖3 6株SS分離株血清9型的PCR鑒定結果

2.4 SS毒力基因型PCR鑒定結果

6株SS9有3種毒力基因型，其中A、D分離株的毒力基因型相同，為epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf2-；B、C分離株的毒力基因型相同，為epf-mrp+slygapdh+fbps+orf2-；E、F分離株的毒力基因型相同，為epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf2+（圖4）。

圖4 6株SS9毒力基因PCR鑒定結果

2.5 SS MLST鑒定及分析結果

2.5.1 SS MLST鑒定結果 利用特異性引物對6株SS9的7個管家基因進行擴增，將擴增片段的測序結果上傳至SS MLST數據庫（http://ssuis.mlst.net），得到13個等位基因，經組合共獲得兩種ST型，其中A、D、E、F分離株ST型相同，為ST1330；B、C分離株ST型相同，為ST243。6株SS9的MLST鑒定結果見表3。

表3 6株SS9的MLST鑒定結果

2.5.2 系統發育樹的構建 利用MEGA 7軟件對6株SS9分離株和7株SS9參考菌株的ST型構建系統發育樹。13株SS9共7種ST型，分為2個大分支，分支1包括ST1330、ST125和ST243，分支2包括ST613、ST790、ST730和ST16。本研究6株SS9分離株同處于分支1上，其中A、D、E、F分離株與B、C分離株分別位于同一進化分支的2個水平；A、D、E、F分離株與參考菌株74602（西班牙）親緣關系較近，而B、C分離株與參考菌株1454（中國江蘇）、65（中國廣州）親緣關系較近（圖5）。

圖5 SS9分離株和參考菌株ST型系統發育樹

3 討論

豬鏈球菌病在我國被劃分為二類動物疫病，病豬因年齡、SS血清型的不同臨床表現各異，其中超急性和急性感染病例發病急、死亡快，給養豬業造成重大經濟損失。自1991年我國首次報道該病以來，SS的分離率逐年遞增，以SS2、SS9兩種血清型居多，且近年來SS9分布越來越廣泛，流行趨勢不斷擴大。徐引弟等[7]對河南省2016年5月至2017年5月分離的189株SS臨床分離株進行血清型鑒定，SS9的分離率為12.7%（24/189）；石大麗等[8]從2018年1—6月廣西部分地區采集的病料中分離出32株SS，其中SS9 為14株，分離率43.75%。本研究對某豬場送檢的疑似SS感染的病豬病料進行細菌分離鑒定，獲得的6株SS均為SS9，分離率高達100%。

研究表明，即使是同一血清型的SS分離株，其毒力也在不斷變化[9]。目前，已知的SS毒力因子大約有61種，分為4大類：表面因子類、酶類、轉錄或調節因子類及其他類[8]。本研究測定了溶菌酶釋放蛋白（mrp）、胞外因子（epf）、溶血素（sly）、毒力相關序列（orf2）、纖連蛋白原結合蛋白（fbps）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gapdh）6種毒力因子在6株SS9分離株中的分布情況，結果共呈現3種毒力基因型，A、D分離株為epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf 2-，B、C分離株為epf-mrp+sly-gapdh+fbps+orf 2-，E、F分離株為epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf 2+，其中epf、gapdh、fbps的檢出情況（epfgapdh+fbps+）與國內已報道SS9毒力基因檢出情況基本一致[2，8，10，11]。Fittipaldi等[12]認為mrp、epf、sly基因與SS的毒力呈正相關，而周俊明等[11]發現部分毒力基因缺失的2株SS9江蘇分離株（mrpepf-sly-orf 2+sao-fbps+gdh+）對小鼠致病力明顯強于2株SS2江蘇分離株（mrp+epf+sly+orf 2+s ao+fbps+gdh+），推測SS9可能存在某些特定的影響致病力強弱的毒力基因尚未被發現，故本研究6株SS9的毒力強弱需結合后續小鼠致病性試驗結果進行判斷。

SS的多位點序列分型（MLST）方法是基于SS基因組中7個管家基因在菌株中的多態性建立的，可用于區分SS的基因型并跟蹤SS潛在流行菌株。SS9菌株具有高度多樣化，不僅在整體水平上表現出遺傳多樣化，而且在進化關系相近的基因型間也表現為毒力基因型的多樣化。Dong等[9]研究了30株SS9分離株（24株中國分離株、5株越南分離株和1株丹麥分離株）ST型與毒力的關系，發現系統發育相關性會導致SS9菌株存在相似的毒力基因型，但即使是同一ST型也會表現出毒力多樣性，其中ST243被認為是SS9中具有高毒力潛力的ST型。本研究6株SS9共分為2個ST型，A、D、E、F分離株為ST1330，與西班牙分離株74602親緣關系較近；B、C分離株為ST243，與江蘇分離株1454和廣州分離株65親緣關系較近；其中A、D分離株，E、F分離株，B、C分離株毒力基因型分別一致，說明同一ST型的SS9菌株毒力基因型不同，與上述結論一致，同時應注意B、C分離株（均為ST243）可能為高毒力菌株。