豬胸膜肺炎放線桿菌血清15型的分離鑒定與藥敏試驗

李 國，張垚垚，王嘉珍，李 郁

（安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae, PCP）是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobczcillus pleuropeumonicze, APP）引起的豬高度致死性呼吸道傳染病，主要臨診特征為肺出血、壞死和纖維素性滲出。PCP傳染性強，任何生長階段的豬均有易感性，世界范圍內各養豬場PCP發病率不斷上升，對養豬業造成的危害不容忽視。根據APP莢膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性差異，可將其分為18種血清型；依據生長是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），又分為兩個生物型，即生物Ⅰ型（NAD依賴型）和生物Ⅱ型（非NAD依賴型），其中血清13、14型為生物Ⅱ型，血清17型菌株生物Ⅰ型和Ⅱ型都有，其他血清型均為生物Ⅰ型。不同國家和地區的APP優勢血清型存在差異，但隨著種豬交流日益增多，一些非典型菌株逐漸流行，其中血清15型菌株分離率呈現上升趨勢[1-2]。不同血清型或同一血清型不同菌株之間臨床致病力不盡相同，且不同血清型之間沒有或僅有較弱的交叉保護力，尤其是目前市場上存在的商品化疫苗僅涉及血清1、2、3和7型，致使疫苗免疫效果常不確實或免疫失敗，從而使該病的防治難度進一步增大。

2021年9—10月，某集團公司在GX、SD地區部分豬場70～300日齡豬只出現疑似PCP疫情，臨床表現為呼吸困難、咳嗽、急性死亡等，剖檢變化均為肺臟淤血，部分為肺臟腫大、肺間質增寬、肺表面有纖維素性滲出，脾臟淤血，發病率為5.0%～30.0%，病死率為1.1%～19.0%。為確定致病原，本試驗采用常規細菌學方法對病料組織進行細菌分離培養與生物型鑒定，PCR技術進行APP及其血清型鑒定、毒力基因型檢測及分離菌株之間的親緣關系鑒定，Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法（簡稱K-B法）測定分離菌株的藥物敏感性。試驗結果不僅為豬場有效防治PCP提供了技術支撐，也為了解區域性APP流行動態提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為某集團公司在GX、SD地區部分豬場疑似PCP的11份病料組織（1份病死豬脾臟和10份病死豬肺臟），相關試驗于2021年9—10月在安徽農業大學動物傳染病研究室開展。

1.2 主要試驗材料

0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）購自杭州微生物試劑有限公司；新生小牛血清購自上海羽哚生物科技有限公司；無菌脫纖維兔血購自南京茂捷微生物科技有限公司；革蘭氏染液購自南京建成生物工程研究所；瓊脂糖、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker購自莫納（武漢）生物科技有限公司；17種抗生素（新霉素、環丙沙星、慶大霉素、頭孢唑林、氧氟沙星、復方新諾明、甲氧芐啶、氨芐西林、氟苯尼考、阿奇霉素、頭孢曲松、丁胺卡那、諾氟沙星、鏈霉素、紅霉素、四環素和林可霉素）購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 質控菌株

肺炎鏈球菌（菌種保藏編號為ATCC49619）和大腸桿菌（菌種保藏編號為ATCC25922）均由安徽農業大學動物傳染病研究室保存，作為測定APP分離株耐藥表型的質控菌株。

1.4 細菌的分離培養及形態學觀察

無菌采取1份病死豬脾臟和10份病死豬肺臟接種于TSA-YE培養基（含5%小牛血清及1.5%NAD）、TSA-YE培養基（含5%小牛血清）、5%兔血瓊脂培養基，置37 ℃條件下培養18～24 h，觀察細菌的生長情況，并挑取單個可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態特征。

1.5 引物合成

參照文獻[3-4]設計PCR鑒定APP及其血清型、毒力基因型引物（表1）。引物均由合肥通用生物科技有限公司合成。

表1 PCR鑒定APP及其血清型、毒力基因型引物序列

1.6 分離菌的PCR鑒定

利用煮沸法提取分離菌基因組DNA作為模板，用于PCR鑒定APP。PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，3個循環；95 ℃ 20 s，57 ℃1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察，并記錄結果。

1.7 NAD依賴試驗

將鑒定為APP的分離菌分別接種于NAD陽性（含5%小牛血清及1.5% NAD）和NAD陰性（只含5%小牛血清，不含NAD）的TSA-YE培養基上，置37 ℃條件下培養18～24 h后觀察其生長情況。

1.8 血清型鑒定

參照1.6提取APP模板DNA，用于PCR鑒定血清型。PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min 30 s，72 ℃2 min 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察，并記錄結果。

1.9 毒力基因鑒定

ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因PCR反應體系（總體積15 μL）：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O 6.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各加0.5 μL，挑取菌落放入配好的PCR體系中，用移液槍吹打均勻，作為DNA模板。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，ApxⅠ65 ℃退火30 s，ApxⅡ63 ℃退火30 s，ApxⅢ、ApxⅣ61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察，并記錄結果。

1.10 毒力基因分析

將含目的基因片段的PCR產物純化后測序，采用DNAStar（Version 7.10）軟件對獲得的毒力基因序列進行序列同源性分析，用MEGA 11.09軟件構建APP的毒力基因序列系統發育樹進行遺傳進化分析。

1.11 藥物敏感性試驗

參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI, 2016）推薦的方法，采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法測定分離株對17種藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離培養及形態學觀察

自11份病死豬組織臟器中各分離1株菌，共計11株。其中，7株于2021年9—10月分離自GX地區部分豬場病死豬脾臟、肺臟，編號為1—7號，4株于2021年10月分離自SD地區部分豬場病死豬肺臟，編號為8—11號。分離菌在TSA-YE培養基（含5%小牛血清及1.5% NAD）上培養24 h后，均呈圓形、表面光滑、灰白色半透明的水珠樣菌落。對TSA培養基（含5%小牛血清和1.5% NAD）上可疑菌落涂片染色鏡檢，分離菌鏡檢結果均為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下觀察均呈細小短桿狀、球桿狀或長絲狀，兩端鈍圓，符合APP的形態學特征（圖1）。

圖1 分離菌培養特性及形態學特征

2.2 分離菌的PCR鑒定

利用APP特異性引物對分離菌進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性對照出現342 bp擴增條帶、陰性對照無條帶出現，試驗結果成立。11株分離菌PCR擴增產物與陽性片段大小均相符，確定為APP，分別命名為GXgg21-1、GXgg21-2、GXgg21-3、GXgg21-4、GXgg21-5、GXgg21-6、GXgg21-7、SDdz21-1、SDdz21-2、SDdz21-3、SDta21-1，編號為1—11號（圖2）。

圖2 分離菌的PCR擴增結果

2.3 NAD依賴試驗

分離菌在NAD陽性的TSA-YE培養基上均生長良好，在NAD陰性的TSA-YE培養基、5%兔血瓊脂培養基上均不生長，均符合生物Ⅰ型APP特征（圖3）。

圖3 分離菌NAD依賴試驗結果

2.4 血清型鑒定

利用APP血清15型特異性引物對APP分離菌進行PCR擴增。結果顯示，生物Ⅰ型APP分離菌均獲得1 575 bp目的片段，與預期片段的大小相符，確定為血清15型（圖4）。

圖4 分離菌的血清型PCR擴增結果

2.5 毒力基因鑒定

對11株APP分離菌的ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ毒力基因進行PCR檢測，結果顯示，分離菌共有3種毒力基因譜，1—5號、8—10號分離菌的毒力基因譜一致，均檢測到ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因，而均未檢測到ApxⅠ毒力基因；6、7號分離菌的毒力基因譜一致，均檢測到ApxⅢ和ApxⅣ基因，而均未檢測到ApxⅠ和ApxⅡ毒力基因；11號分離菌檢測到ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ基因，而未檢測到ApxⅢ基因（表2、圖5）。

表2 APP分離菌血清15型毒力基因檢測結果

圖5 11株APP分離菌毒力基因的PCR鑒定

2.6 毒力基因分析

利用DNAStar（Version 7.10）軟件對APP分離菌的ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因序列進行比對。結果顯示，9株APP分離菌（1—5號、8—11號分離菌）的ApxⅡ基因相似度為97.1%～100.0%，其中1、2號，5、11號，8、9號分離菌的ApxⅡ基因相似度為100.0%，高度同源；10株APP分離菌（1—10號分離菌）的ApxⅢ基因相似度為99.0%～100.0%，其中1、2、7號，3、5號，4、6號，8、9號分離菌的ApxⅢ基因相似度為100.0%，高度同源；11株APP分離菌（1—11號分離菌）的ApxⅣ基因相似度為96.5%～100.0%，其中1號、2號、5—10號分離菌的ApxⅣ基因相似度為100.0%，高度同源（圖6）。

圖6 ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ毒力基因核苷酸序列

用Maximum Likeihood tree方法分別構建APPApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ毒力基因核苷酸序列系統進化樹。結果顯示9株APP分離菌ApxⅡ基因序列分為兩個分支，1、2、4、10號分離菌同處于分支一，其中1、2、4，10分別處于同一分支的2個水平上；3、5、8、9、11號分離菌同處于分支二，其中5、11，3、8、9分別處于同一分支的2個水平上。10株APP分離菌ApxⅢ基因序列分為兩個分支，其中1、2、7號分離菌同處于分支一；3—6、8—10號分離菌同處于分支二，4，3、5、10，6、8、9分別處于同一分支的不同水平上；11株APP分離菌ApxⅣ基因序列同處于分支一，其中1—10號，11號分離菌分別處于同一分支的2個水平上（圖7）。

圖7 11株APP分離菌毒力基因核苷酸序列系統發育樹分析

綜上可見，1—11號APP分離菌具有極近的親緣關系，與目前國內外部分APP流行菌株同源性高，親緣關系較密切，其中1、2號，8、9號分離菌分離自同一場區，且1、2號，8、9號分離株的ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因核苷酸序列相似度均達100%，并處于系統發育樹的同一分支，高度同源，為同一菌株。

2.7 藥物敏感性試驗

根據CLSI執行標準判斷，質控菌株的抑菌圈大小在規定范圍內。1—11號APP分離菌對氧氟沙星和甲氧芐啶的敏感率最高（81.8%），其次是環丙沙星、頭孢唑林和阿奇霉素（敏感率為72.7%），對氨芐西林、復方新諾明、頭孢曲松、慶大霉素和諾氟沙星的敏感率為63.6%～54.5%，對丁胺卡那、新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、林可霉素、紅霉素和四環素的耐藥率為45.5%～90.9%（表3）。

表3 1—11號APP分離菌藥物敏感性試驗結果

3 討論

APP主要定居于豬的呼吸道并且具有高度宿主特異性，各個生長階段的豬均可感染。PCP具有較強的季節性，多發生在春夏交接的4～5月和秋冬交接的9～11月，飼養密度、濕度、舍內氨氣和粉塵過高、氣溫驟變、飼養環境的突然改變、混群、轉群、擁擠、長途運輸等應激因素是豬群發病的原因。隨著現代化養豬生物安全措施加強、管理理念提升、生產工藝的改進、溫控條件的改善，由天氣突變造成的影響可能越來越小。每年1～2月是生豬的消費旺季，導致存欄豬減少；而3～5月與10～12月發病報道數增多的原因，可能與年后生豬滯銷造成存欄增多，年前銷售壓欄待價有關，導致欄舍密度、氨氣濃度、粉塵等增多，PCP死亡案例數報道增多。

本試驗針對2021年9—10月，某集團公司在GX、SD地區部分豬場70～300日齡豬只出現的疑似PCP疫情，在掌握相關信息的基礎上，包括飼養數量、飼養方式、免疫接種、發病時間、病程進展、用藥情況、發病率與病死率等，以及發病時的臨床表現和病理剖檢變化，通過常規細菌學鑒定方法，采集病料組織進行細菌分離培養與生物型鑒定，應用PCR技術對分離菌進行APP及其血清型鑒定、毒力基因檢測以及分離菌之間親緣關系的確定。結果顯示，從疑似APP感染的11份（GX地區7份，SD地區4份）病死豬組織中均分離獲得歸屬于生物Ⅰ型、血清15型的APP。APP分離菌共有3種毒力基因譜，為ApxⅠ-ApxⅡ+ApxⅢ+ApxⅣ+、ApxⅠ-ApxⅡ-ApxⅢ+ApxⅣ+和ApxⅠ+ApxⅡ+ApxⅢ-ApxⅣ+。APP的一種血清型只能產2種或3種Apx毒素，能同時產生ApxⅠ和ApxⅡ毒素的毒性最強[5]，由此毒力基因譜為ApxⅠ+ApxⅡ+ApxⅢ-ApxⅣ+的11號APP分離菌毒力可能較強。11株APP分離菌之間具有極近的親緣關系，同時也與國內外部分APP流行菌株同源性高，關系較密切，其中1、2號，8、9號APP分離菌為同一菌株。目前，國外以血清1、5和7型最為流行，國內優勢血清型雖主要為血清7、1和3型，其次為血清5、11、10和13型，然而血清5、11、15和1型菌株分離率呈現逐年增高的趨勢[6]。這不僅表明不同地區流行的APP優勢菌株不同，同時也提示APP流行血清型處于動態變化中，現存的商品化疫苗可能并不與各地流行的優勢菌株相契合。因此，實時監測生產實際中APP流行血清型動態變化是豬場實施長期防治的重要參考。

對PCP的綜合防制措施主要包括加強飼養管理、藥物防治、預防接種等。免疫接種是預防PCP的有效方法，但APP血清型眾多，且相互間交叉保護力弱，因此疫苗中所含APP血清型的選擇，要根據具體情況確定。對受威脅但未發病的豬群，可以進行預防性給藥。對于發病豬群，早期及時治療是有效的降低損失的方法。本次試驗藥敏結果顯示，1—11號APP分離菌對氧氟沙星和甲氧芐啶的敏感率最高（81.8%），可作為首選治療藥物，其次是環丙沙星、頭孢唑林和阿奇霉素（敏感率為72.7%），對氨芐西林、復方新諾明、頭孢曲松、慶大霉素、諾氟沙星的敏感率為63.6%～54.5%，對丁胺卡那、新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、林可霉素、紅霉素和四環素則具有不同程度的耐藥率（45.5%～90.9%）。據國內外研究報道，源自美國和加拿大的312株APP分離菌對頭孢噻呋和氟苯尼考的敏感率均為100%，對托拉菌素和恩諾沙星的敏感率分別為99%和90%，對四環素類藥物耐藥率為94%～100%[7]。源自塞爾維亞的148株APP分離菌對頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考敏感率均為100%，75%分離菌對一種或多種藥物具有耐藥性，對四環素和鏈霉素的耐藥率分別為34%和31%[8]。我國11株APP四川分離菌呈多重耐藥現象，對四環素和多西環素耐藥率為90.90%；對鹽酸林可霉素、復方新諾明和鏈霉素耐藥率為54.55%[9]。31株APP貴州分離菌對頭孢噻吩和頭孢拉定敏感率分別為29.03%和22.58%，對青霉素、氨芐西林等10種抗生素耐藥率均為100%，呈10重耐藥[10]。表明不同來源APP分離菌的耐藥性呈現區域耐藥、多重耐藥特點，因此應通過藥敏試驗確定行之有效的臨床治療藥物，同時應注意使用現行敏感抗菌藥物也要謹慎，輪換、穿梭用藥結合，關注耐藥性變化趨勢，防止藥物選擇壓力加重APP多重耐藥程度，給PCP的防治帶來困難。此外，8、9號APP分離菌雖鑒定為同一菌株，但對包括頭孢曲松、慶大霉素等在內的7種抗生素的藥物敏感性存在差異，推測可能是由于人類、動物和環境之間的活動與聯系，加強了耐藥細菌及耐藥基因的傳播，致使耐藥差異性的出現[11]。