豬ADAMTS1基因的多態性與產仔數性狀的關聯分析

劉林清，李慶崗，王重龍

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

ADAMTS1是一種具有血栓反應基序的分解素和金屬蛋白酶，為ADAMTS家族的成員之一，目前ADAMTS家族共發現19個成員[1-2]，主要參與生物體內受精過程、炎癥反應等[3]。ADAMTS1（含凝血酶敏感蛋白模體的去解聯金屬蛋白酶）基因被靶向失活會導致雌性動物不孕和發育遲緩[4-6]。Shindo等[7]研究發現，人絨毛膜促性腺激素（hCG）注射到小鼠4 h后可檢測到ADAMTS1基因的表達，并且在卵泡破裂12 h后其表達量達到高峰，表明ADAMTS1在卵泡破裂過程中發揮著關鍵作用。這些研究結果進一步暗示了ADAMTS1基因在排卵過程后都發揮著作用。

為此，本研究建立了ADAMTS1基因的PCRPvuⅡ-RFLP分型技術，并在淮豬新品系Ⅱ豬群中進行多態性分型，檢測該位點的多態性及其與產仔數性狀進行關聯分析，以期為提高豬產仔數提供一個有用的分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物及組織采集 試驗開展時間和地點：于2021年8月在安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所開展的試驗；試驗樣本采集的地點和時間：于2014年7月在安徽省科鑫養豬育種有限公司采集85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織放置于75%酒精的離心管中，-20 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 引物的設計與合成 根據ADAMTS1基因DNA序列，應用Premier 5.0軟件在多態位點（第7外顯子）兩側，設計一對引物，突變位點可用限制性內切酶PvuⅡ識別，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：ADAMTS1基因的上游引物：5'-TGGGGAGATTGTTCCAGAAC-3'，下游引物：5'-CTGCAGAACGAAGAAGTAGCC-3'，片段長度為413 bp，退火溫度為65.0 ℃。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系為25 μL，其中PCR 2×Taqmix 12.5 μL，10 mmol/μL的引物各0.5 μL，DNA模板1 μL（DNA約100 ng），加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為第1步95 ℃變性5 min；第2步95 ℃變性45 s；第3步65.0 ℃復性40 s；第4步72 ℃延伸40 s；重復第2至第4步35個循環，之后再72 ℃延伸10 min，最后降溫至4 ℃保存。PCR擴增產物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統中觀察，可見到片段大小為413 bp的清晰條帶。

1.2.4 限制性內切酶酶切（RFLP） ADAMTS1基因的PCR產物用PvuⅡ內切酶酶切，反應體系為：10×Buffer 1 μL，PvuⅡ酶0.30 μL（10 U/μL），加PCR產物至10 μL；37 ℃反應8～12 h；然后，酶切產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統中觀察。

1.3 數據處理分析

1.3.1 統計分析的軟件 采用SAS 8.0統計軟件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序進行標記方差分析，并進行顯著性檢驗。

1.3.2 基因效應統計分析模型 依據Liu等[8]所述方法建立的單標記回歸統計模型，除了豬個體為隨機效應以外，其他因素均為固定效應。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效應+殘差，其中Y為性狀表型值。

2 結果與分析

2.1 豬ADAMTS1基因的多態位點檢測

PCR擴增片段長度為413 bp，經PvuⅡ酶切后產生3種基因型（圖1）。當多態位點為BB基因型時，則造成了PvuⅡ酶切位點，PCR產物經PvuⅡ消化后產生2個片段（316 bp+97 bp），記為等位基因B；當多態位點為AA基因型時，則酶切位點消失，PCR產物經PvuⅡ消化后產生1個片段（413 bp），記作等位基因A。

圖1 豬ADAMTS1基因PvuⅡ酶切分型結果

2.2 豬ADAMTS1基因在淮豬新品系Ⅱ系豬群體中的基因型和等位基因的頻率分布

由表1可見，ADAMTS1基因PvuⅡ酶切位點在所檢測的豬群中，發現B等位基因占優勢。

2.3 豬ADAMTS1基因PvuⅡ多態位點基因型與豬產仔數性狀的關聯分析

應用基因效應統計分析模型，采用SAS統計軟件的GLM程序在淮豬新品系Ⅱ系豬群體中進行豬ADAMTS1基因PCR-PvuⅡ-RFLP多態位點與產仔數性狀的關聯分析。

在淮豬新品系Ⅱ系豬群體中，所有胎次產仔數均呈現AB＞BB＞AA的趨勢。其中，AB型個體的所有胎次產仔數顯著高于BB型個體0.665頭（P＜0.05），詳見表2。統計結果顯示，AB型和BB型母豬具有較高的產仔數，B等位基因為優勢等位基因。

表2 ADAMTS1基因PCR-Pvu Ⅱ-RFLP基因型與淮豬新品系Ⅱ產仔數性狀的統計分析

3 討論

淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優良地方品種淮豬為母本，以國外優質瘦肉型品種長白豬、大白豬為父本，經過雜交育種組建基礎群，然后運用標記輔助選擇BLUP估計育種值進行群體繼代選育的。ADAMTS1是一種具有血栓反應基序的分解素和金屬蛋白酶，為ADAMTS家族的成員之一，在卵泡發育、排卵過程中，ADAMTS1都發揮著重要作用，這與樂凱[9]的研究結果是一致的。在組織和細胞水平分析了豬ADAMTS1基因的表達模式，發現豬ADAMTS1基因受促性腺激素的誘導，在排卵前卵泡顆粒細胞中瞬時表達，也驗證了ADAMTS1在排卵前發揮著重要作用。

本研究發現，ADAMTS1基因PvuⅡ酶切位點在淮豬新品系Ⅱ系豬群體中檢測發現B等位基因占優勢，并且在所有胎次產仔數呈現AB＞BB＞AA的趨勢。其中，AB型個體的所有胎次產仔數顯著高于BB型個體0.665頭（P＜0.05）。以上結果表明，AB型和BB型母豬具有較高的產仔數，B等位基因為優勢等位基因。這與其他研究者報道是一致的[10]。同時ADAMTS1基因存在于第7外顯子72 bp上的C/G突變，該突變導致622位的精氨酸變成了脯氨酸，表明可能脯氨酸的改變會提高了母豬卵泡發育和排卵能力，從而提高母豬的產仔數。而在淮豬新品系Ⅱ系豬群中B等位基因達到較高水平，因此在今后選育中可適當提高B等位基因的頻率。