海南五指山豬VRTN基因的檢測分析

晁 哲，邢漫萍，黃麗麗，孫瑞萍，劉海隆，王 峰

（1.海南省農業科學院畜牧獸醫研究所，海南 海口 571100；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南 海口 571100）

哺乳動物的脊椎分為頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎共5個部分，人的脊椎數目和肋骨數目是固定的，豬、牛、羊等家畜的多脊椎和多肋骨現象比較常見[1]。豬的脊椎數變異主要發生在胸椎和腰椎，頸椎、薦椎和尾椎數目相對固定。中國地方豬種的胸腰椎總數一般為19～20根，西方商業豬種的胸腰椎總數為21～23根[2]。脊椎數是影響豬生產性能的重要因素，與其相關的性狀主要有體長、胴體長、肋骨數和產肉量等。對于肉用商品豬，增加脊椎數有利于提高產肉量、擴大養殖經濟效益；對于實驗動物小型豬，減少脊椎數有利于降低體重體尺、提升試驗操作的便利性。因此，開展豬多脊椎遺傳機理研究，把脊椎數作為主要的選育指標對于我國地方豬保護與開發利用具有重要意義。

椎骨發育相關基因（vertebrate development associated, VRTN）是哺乳動物脊椎生長發育的關鍵基因之一[3]。豬VRTN基因位于第7號染色體上，包含2個外顯子和1個內含子，在其內含子中存在一個291 bp的插入突變，該突變已被證實與豬胸椎數、胴體長、肋骨數等多個性狀表型變異相關[4-5]。本研究一方面通過基因測序鑒定五指山豬VRTN基因的變異情況，另一方面通過PCR擴增檢測五指山豬VRTN基因中是否存在291 bp的插入突變，為五指山豬肉用品系和實驗動物品系的選育提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2021年9月15日至11月15日在海南省農業科學院畜牧獸醫研究所進行。

1.2 試驗材料

87頭五指山豬和7頭大白豬來自海南省農業科學院畜牧獸醫研究所永發科研基地，采集耳組織后利用基因組提取試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。

1.3 引物合成

根據NCBI中提供的豬VRTN基因組序列（Gene ID: 100157734），使用Primer Premier 5.0軟件設計5對引物擴增五指山豬和大白豬的VRTN基因序列，通過序列比對尋找基因中的SNP位點；VRTN基因內含子中插入突變（插入片段291 bp左右）的檢測引物參照Yang等[4]發表的文章，引物信息詳見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為25 μL：其中模板DNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，滅菌去離子水9.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃變性4 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸50～90 s（由片段長度決定），共36個循環；72 ℃延伸7 min。

1.5 電泳檢測

通過2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。

2 結果與分析

2.1 豬VRTN基因序列分析

使用5對特異性引物擴增豬VRTN基因后，獲得5個VRTN基因擴增片段，長度分別為631、1 122、1 251、773和1 136 bp（圖1），擴增片段包含VRTN基因全部外顯子和部分內含子，擴增后的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。通過比對五指山豬和大白豬的VRTN基因序列，在該基因第2外顯子中共發現10個單堿基突變位點（表2），其中+2 445處的A/G突變位于3′非翻譯區、其它9個突變位于編碼區。+1 331處的A/G突變、+1 730處的A/G突變和+1 769處的C/T突變屬于錯義突變，其它6個編碼區的突變均是同義突變。

圖1 豬VRTN基因PCR擴增片段電泳結果

表2 五指山豬與大白豬VRTN基因序列比對結果

2.2 五指山豬VRTN基因內含子291 bp插入突變檢測

使用VRTN-F/VRTN-R引物擴增VRTN基因目的片段，不含291 bp插入突變的純合子擴增條帶為120 bp，含有291 bp插入突變的純合子擴增條帶為411 bp，含有291 bp插入突變的雜合子擴增條帶為120 bp和411 bp。在檢測的87頭五指山豬中，85頭不含291 bp插入突變，2頭是有291 bp 插入突變的雜合子，未發現291 bp插入突變的純合子（圖2）。

圖2 五指山豬VRTN基因插入突變電泳檢測結果

3 討論

五指山豬是中國特有的小型豬種，是重要的產肉動物和醫學實驗動物，在生產和科研上都具有重要價值[6]。五指山豬的生長發育與大白豬等現代家豬有較大差異，對照明顯，且表型獨特。主要表現在：①五指山豬的體型與現代家豬相反，前軀寬大（種公豬更明顯），后軀較小，后腿比例（后腿重量占胴體重量的百分比）明顯低于現代家豬；②五指山豬的體重輕，成年豬（按2年計算）體重50～75 kg，遠低于現代家豬。③五指山豬的飼料轉化率低，料重比超過5，生長發育慢于現代家豬。因此，五指山豬是研究豬生長發育機制的理想實驗動物。

脊椎數目影響豬體型生長發育，屬于高遺傳力性狀。Mikawa等[7]使用大白豬等多個豬資源群體為參考，在第1號和第7號染色體上定位到2個影響豬脊椎數目的數量性狀位點（QTL, quantitative trait loci），進一步精細定位發現1號染色體上的NR6A1基因和7號染色體上的VRTN基因都是影響豬脊椎數變異的重要候選基因。由于NR6A1基因的有利等位基因在西方商業群體中經過高度人工選擇已經固定，所以VRTN基因受到更多的關注[8]。隨著研究的深入，豬VRTN基因內含子中的1個插入突變（插入片段291 bp左右）被發現與胸腰椎數變異相關，并逐步在中外多個豬種中得到驗證[9]。在中國地方豬種中，VRTN基因內含子中291 bp插入突變比例較低，相反在大白豬、長白豬、杜洛克豬等西方商業豬種中，該位點插入突變比例很高，這與西方商業豬種的胸腰椎數目多、肋骨數多、體型較長相一致。

我們前期屠宰測定發現，五指山豬胸椎13～15個、腰椎5～6個、肋骨數為14～15根，均低于大白豬等多數中外豬種。結合本次檢測結果，絕大部分五指山豬的VRTN基因內含子中都不含有291 bp插入突變，進一步驗證該插入突變對脊椎數變異存在影響。從五指山豬與大白豬VRTN基因中10處突變位點的序列比較結果可以看出，大白豬VRTN基因純合度較高，10處突變位點中有5處是單一基因型，相反，五指山豬中的這10處突變位點的基因型均呈現多態或偏態。值得注意的是，五指山豬中有3個錯義突變，+1 331處的A/G突變導致天冬酰胺變為絲氨酸、+1 730處的A/G突變導致天冬氨酸變為甘氨酸、+1 769處的C/T突變導致蘇氨酸變為異亮氨酸，這3個錯義突變是否是五指山豬特有的還需進一步驗證。

綜上所述，可以通過對VRTN基因型的選擇增加或減少胸椎數量，達到增加或降低體重體尺的目標，在五指山豬肉用開發或實驗動物培育中，VRTN基因可以作為一種有效的分子標記，對脊椎數和體長相關性狀的選育有重要的應用價值。

4 結論

五指山豬外顯子中存在10處堿基突變位點，其中9個位于編碼區、1個位于3′非翻譯區，突變位點中有3個錯義突變，分別是+1 331處的A/G突變、+1 730處的A/G突變和+1 769處的C/T突變；此外，五指山豬VRTN基因內含子中含有291 bp左右的插入突變，但頻率極低。