不同稀釋法對公豬冷凍精液品質的影響

周 健，曹婷婷，2，曹俊新，趙云翔，2

（1.廣西貴港秀博基因科技股份有限公司，廣西 貴港 537100；2.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528000）

公豬精子對溫度變化十分敏感，在冷凍保存過程中極易受到冷凍損傷，雖然Polge等[1]在1956年首次運用凍精技術進行人工授精（AI）并獲得仔豬，但是到目前為止世界范圍內豬冷凍精液應用比例仍沒超過1%。冷凍保護液是影響凍精冷凍效果的主要因素之一，目前常用以卵黃為基礎的稀釋液添加冷凍保護劑來進行凍精研究。常用的冷凍保護劑有甘油、DMSO（二甲基亞砜）、乙二醇等，這些滲透性冷凍保護劑雖然具有優異的抗凍作用，但均具有細胞毒性，所以多數會在冷凍前進行添加，以降低不良影響。一步稀釋法和兩步稀釋法進行精液冷凍主要是針對冷凍保護劑的細胞毒性衍生出來的冷凍方法，雖然現在以兩步稀釋法冷凍公豬精液在實驗室層面得到滿意且穩定的冷凍效果，但兩步稀釋法在實際生產中會增加處理時間。為提高生產效率，進行一步稀釋冷凍試驗，探索一步稀釋法冷凍豬精技術。據相關報道，不同稀釋方法的凍精研究已在絨山羊[2]、牛[3]、犬[4]等動物上得到應用，但冷凍效果參差不齊。為了提高精子的凍融質量，OEP （Orvus ES Paste）、ESP（Equex STM Paste）作為新型冷凍保護劑已被應用到凍精研究中。OEP、ESP是一類表面活性劑，對精子膜結構有保護修補作用，主要含有十二烷基硫酸鈉（SDS）復合物，能夠提高凍融精子活率、活力及質膜完整率[5]。精液在超低溫下可以長期有效的保存，這對于保護種豬種質資源及基因傳遞具有突出的優勢。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及精液采集

試驗動物為沈陽秀博種豬繁育科技有限公司提供的體質健壯、性欲旺盛的6頭成年杜洛克公豬，采集2021年12月份公豬精液作為樣本，在揚翔農牧育種中心北方凍精實驗室進行試驗。每頭公豬精液均分成2份，每份3個重復，分別進行一步稀釋法冷凍精液和兩步稀釋法冷凍精液。使用自動采精設備對試驗公豬進行原精采集，通過精液傳動系統將采集好的原精傳送到精液檢測實驗室，利用IVOS II（法國，IMV）精子自動檢測儀進行精液質量評估。原精要求：精子活力≥90%，精子密度≥2億/mL，精子畸形率≤10%。

1.2 主要試驗儀器及試劑

TurboFreezerM程序冷凍儀（米尼圖）、HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州澳華）、EasyCoder 2.0色帶打印機（米尼圖）、KDC-2046低速冷凍離心機（安徽中科）、冷凍精子平衡柜（米尼圖）、精子檢測分析儀（IVOS II, IMV）、單頭灌裝機MPPUno（米尼圖）、0.5 mL凍精細管（米尼圖）。甘油（Sigma）、乳化劑Equex-Paste（米尼圖）、檸檬酸鈉（Sigma）、果糖（Sigma）、Androstar?CryoPlus、新鮮卵黃。

1.3 冷凍保護液配制

Ⅰ組冷凍保護液配制：首先在1 000 mL的燒杯中準確倒入770 mL超純水，在磁力攪拌器上攪拌并加熱至34 ℃，此時緩緩倒入Androstar?CryoPlus基礎稀釋粉，充分攪拌溶解，待溶液pH穩定后加200 mL新鮮卵黃并充分攪拌溶解，向溶液中添加30 mL甘油和5 g乳化劑Equex-Paste，充分攪拌溶解后使甘油濃度為3%、乳化劑Equex-Paste濃度為0.5%，作為Ⅰ組冷凍保護液。

Ⅱ組冷凍保護液配制：本組冷凍保護液分為冷卻液A和冷凍液B，主要配制如下：用770 mL超純水溶解Androstar?CryoPlus基礎稀釋粉，34 ℃下充分攪拌溶解，待溶液pH穩定后加200 mL新鮮卵黃并充分攪拌溶解，取出500 mL作為冷卻液A；向剩余溶液中添加30 mL甘油和5 g乳化劑Equex-Paste，充分攪拌溶解后作為冷凍液B，冷凍液B中甘油和乳化劑含量分別為6%和1%。

1.4 精液冷凍處理

1.4.1 Ⅰ組冷凍保護液冷凍處理（一步稀釋） 檢測合格的精液使用常溫稀釋液進行1～2倍等溫稀釋，梯度降溫至17 ℃，在此溫度下900 g離心20 min，抽棄上清液后添加Ⅰ組冷凍保護液，調整精液終密度為8億/mL，充分混勻懸浮后置于5 ℃平衡柜中降溫150 min，使用單頭灌裝機（MPPUno）灌裝成0.5 mL/支進行程序化冷凍，具體降溫曲線如下：5 ℃降至-6 ℃用時200 s，-6 ℃停留60 s，-6 ℃降至-100 ℃用時144 s，-100 ℃降至-140 ℃用時80 s。

1.4.2 Ⅱ組冷凍保護液冷凍處理（兩步稀釋） 使用Ⅰ組同樣的方法進行原精稀釋并17 ℃離心，之后添加冷卻液A，使用移液器懸浮混勻后放置于5 ℃平衡柜中降溫150 min，添加含有甘油和乳化劑Equex-Paste的冷凍液B，調整精液終濃度為8億/mL，充分渦旋混勻后灌裝成0.5 mL/支，使用與一步稀釋相同的降溫程序進行冷凍。

1.5 凍精解凍及精子運動性檢測

從液氮罐中取出凍存3 d以上的凍精細管，迅速放入50 ℃水浴鍋中，水浴解凍16 s，迅速拿出放入到34 ℃水浴中緩孵，使用吸水紙擦干細管，把管中氣泡輕搖到封口段，在氣泡處剪開，開口向上，翻轉細管把精液流入預先預熱至34 ℃的解凍液中，1支冷凍精液加入到8 mL解凍液中，平衡5～20 min，使用IVOS II精子分析儀進行精子運動性能評估，主要檢測參數包括活力（MOT，%）、前向精子（PM，%）、VCL（曲線速度，μm/s）、VSL（直線速度，μm/s）、VAP（平均路徑速度，μm/s）、ALH（精子頭側擺幅度，μm）、LIN（直線性，%）、STR（前向性，%）及BCF（鞭打頻率，Hz）。

1.6 解凍后精子質膜完整性評估

本試驗采用低滲腫脹試驗來評估解凍后精子質膜完整性（plasma membrane-intact, PMI），根據Revell等[6]的方法配制低滲腫脹液，低滲腫脹液（HOST）配制：將0.735 g檸檬酸鈉和1.351 g果糖溶解在100 mL超純水中來制備HOST溶液（滲透濃度約190 mOsmol/kg）。為了評估精子質膜的完整性，解凍后將50 μL精液樣品與500 μL預熱的HOST溶液混合，并在37 ℃下孵育30 min。溫育后，取1滴精液進行400×顯微鏡檢測。判斷標準：尾部腫脹彎曲的預示完整的、具有生物學活性的精子膜，尾部未膨脹彎曲的表明損壞的、無正常生物學功能的精子膜，見圖1。

圖1 低滲腫脹試驗

1.7 數據統計與分析

數據先使用Excel處理，再使用SAS 9.2軟件進行單因素方差檢驗，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 試驗結果與分析

冷凍解凍后精子活力（MOT）、前向精子（PM）、直線速度（VSL）、曲線速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、鞭打頻率（BCF）及質膜完整性（PMI）兩組之間差異極顯著（P＜0.01），而解凍后直線性（LIN）、前向性（STR）、精子頭側擺幅度（ALH）兩組之間差異不顯著（P＞0.05），詳見表1和表2。

表1 解凍后精子活力、前向精子以及運動速度對比

表2 解凍后精子運動參數及質膜完整性對比

3 討論

本試驗結果表明，杜洛克精液17 ℃離心后兩步稀釋法的冷凍效果優于一步稀釋法，兩步稀釋法凍融后精子運動性能和質膜完整性高于一步稀釋法。路佩瑤等、胡月超、王素梅等分別在絨山羊、公牛和寵物犬上進行相似的研究[2-4]，但與本試驗不同的是冷凍保護液里沒有添加OEP類物質。

眾所周知，甘油是十分常用的滲透性冷凍保護劑，但甘油本身也具有一定的細胞毒性，對精子毒性的大小與濃度相關[7]。甘油與精細胞較長時間接觸會誘導膜的不穩定。甘油對精子提供低溫保護效果的同時，由于冷凍的前處理會對精子結構造成一定的損害，這種損害目前是不可避免的。在一步稀釋法中甘油與精子接觸時間較長，增加了甘油對精子膜的損傷，本試驗也證明了這一點。若一步稀釋法中縮短5 ℃平衡時間，或許會提高精液冷凍效果。劉興偉等[8]冷凍遼寧絨山羊精液的研究結果表明，在先用不含甘油的稀釋液進行第1次稀釋，在冷凍前再用含甘油的稀釋液進行第2次稀釋，其冷凍效果優于直接使用含有甘油的一次稀釋法。而吳云海等[9]對種公牛精液的研究結果表明，采用一步稀釋法稀釋精液同樣也能達到比較理想的冷凍效果。這可能是與不同物種的精子對甘油毒性的耐受程度有關。

相關報道指出，在冷凍稀釋劑中添加乳化劑Orvus ES Paste（OEP）可更好地保護質膜[10]。據李新紅等[11]研究證明，OEP可使卵黃中的有益成分與犬精子膜更好地相互作用，從而降低冷凍損傷。在含有鴕鳥卵黃和甘油的稀釋劑中添加0.25%和0.50%的OEP可以增強精子凍融后線粒體功能、總運動性、質膜完整性和頂體完整性[12]。Pe?a等[13]認為，ESP、OEP等成分具有黏性，對精子膜結構中的脂類具有穩定作用，可以降低或者阻礙由冷凍保存所引起的似獲能性變化，從而起到保護質膜和頂體的作用。而Pontbriand等[14]猜測OEP不是直接作用于精子質膜，而是通過乳化卵黃中的類脂形成較小聚合體，這些微小的類脂聚合體更有利于維持精子質膜的流動性，從而達到保護作用，這種猜測還沒有確切的證據來證明。

本試驗與其他類似試驗不同的是，同時控制甘油和OEP分步添加，雖然兩組試驗其終濃度保持一致，但兩者對精子的作用時間不同，這可能是造成冷凍效果不同的主要原因。本試驗采用終濃度0.5%的OEP進行兩步稀釋冷凍試驗，得到了比較滿意的冷凍效果，這與Fraser等[12]的試驗結果類似。從一步稀釋試驗的結果看，甘油和OEP在17 ℃離心后直接添加對精液冷凍產生了不利影響，除了甘油本身的毒性所致，還沒有相關報道證明是因為OEP直接添加所致。根據相關報道精子細胞長時間暴露于經SDS處理的卵黃基礎稀釋液中可能對精子功能產生負面影響[15-16]，因此可以大膽地猜測較高濃度的OEP跟精子較長時間的接觸也可能會對杜洛克精子產生不利影響，這可能是造成第一組試驗冷凍效果差的原因之一。

4 結論

使用本試驗冷凍保護液進行公豬精液冷凍，17 ℃離心后采用兩步稀釋法進行冷凍后，其解凍后精子活力、前向精子、精子運動速度和質膜完整性等參數顯著高于一步稀釋組。