國槐SSR-PCR反應體系的建立與優化

張明靜，龐彩紅，李際紅，李雙云，付茵茵，哈新英，夏陽

（1．山東省林業科學研究院/山東省林木遺傳改良重點實驗室/黃河三角洲林木遺傳育種國家林草局重點實驗室，山東 濟南 250014；2．山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014；3．山東農業大學林學院，山東 泰安 271018；4．濟南市城鄉建設發展中心，山東 濟南 250000）

國槐（Sophora japonica L．）為豆科（Leguminosae sp．）蝶形花亞科（Papilionoideae）槐屬（Sophora L．）落葉喬木，是我國北方重要的鄉土樹種和城市綠化樹種，具有較高的觀賞價值［1］；其速生性較強，材質堅硬，花、枝、果實等均可入藥［2］，也是良好的材用和藥用經濟樹種。目前，國內關于國槐的研究還主要集中在繁殖技術［3］、遺傳轉化［4］以及種子表型性狀的變異［5］等方面，針對其分子方面的研究開展較少，嚴重影響國槐種質資源的創新和利用。

目前應用于植物遺傳育種研究的分子標記技術主要有AFLP、RAPD、RFLP、SSR、ISSR等。SSR（simple sequence repeat）即簡單重復序列，又稱微衛星。通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳或高濃度的瓊脂糖凝膠電泳對SSR-PCR產物進行檢測，其結果可以顯示出不同品種間重復次數帶來的差異性［6］。SSR標記由于多態性高、數量豐富、在遺傳上呈共顯性、實驗方法簡單、結果相對穩定可靠等優點，被廣泛應用于DNA指紋圖譜構建［7，8］、分子輔助選擇［9］和遺傳多樣性分析［10］等研究中，是目前應用比較廣泛的一種分子標記技術。

本研究旨在利用單因素試驗結合正交試驗設計，建立一套適用于國槐SSR標記的穩定、可靠的PCR反應體系，以期為利用SSR分子標記技術對國槐進行遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、種質資源鑒定等方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 試驗材料與試劑

選用國槐種質WF56、TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396，均為嫁接保存于山東省林業科學研究院飲馬泉苗圃及章丘實驗基地的國槐古樹，具體源生地見表1。2016年春天，從國槐嫁接苗上采集嫩葉，清洗干凈，放入2 mL離心管中，編號，液氮迅速冷凍后放入-50℃冰箱備用。

植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根公司；DNA Marker、ExTaq酶、10×Taq Buffer、MgCl2、dNTPs、6×Loading Buffer等均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；冰乙酸、硝酸銀、無水乙醇購自天津市凱通化學試劑有限公司。

表1 國槐種質材料的源生地

利用高通量測序平臺Illumina HiSeq 2000進行國槐轉錄組測序，測得7 Gb數據，進行數據denovo組裝，共獲得68 846個uigene，使用SSR軟件MIcroSAtellite（MISA）尋找所有的SSR位點，對所有SSR重復單元在Unigene上前后序列的長度進行篩選，得到8 718條包含SSR位點的序列，共含有10 236個SSR位點，設計完成6 611條引物。從中選出226對引物由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成，每對引物5 OD，分裝兩管，-20℃冰箱保存備用。從226對引物中隨機挑選5對引物（表2）用于本試驗。

表2 選用的SSR-PCR引物及其序列

1．2 試驗方法

1．2．1 國槐基因組DNA的提取與檢測 采用植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。利用0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，使用分光光度計測定提取的DNA濃度，根據分光光度計測定的DNA原液濃度將樣品稀釋至所需濃度，置于-20℃冰箱中保存備用。

1．2．2 PCR擴增程序及產物檢測 采用Touchdown PCR擴增，程序如下：94℃5 min；94℃15 s，66．5～57．0℃15 s（每循環降0．5℃），72℃30 s，19個循環；94℃15 s，57℃15 s，72℃30 s，15個循環；72℃10 min，4℃保存。擴增后的產物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染顯色，相機拍照保存。

1．2．3 PCR擴增反應體系優化 隨機挑選WF56國槐DNA為模板，利用2114引物進行PCR擴增，初始反應體系（10μL）：5 U/μL ExTaq酶0．1μL，25 mmol/L Mg2+1．0μL，2．5 mmol/L dNTPs 0．4μL，10μmol/L引物0．2μL（上下游引物合計），70 ng/μL模板DNA 1．0μL，10×PCR Buffer 1．0μL，ddH2O補足到10μL。

采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法對SSR-PCR反應體系中的Mg2+、引物、dNTPs、Ex-Taq酶、模板DNA用量五個因素進行優化。單因素試驗中每個因素設置6個水平（表3），根據擴增條帶清晰度確定各因素的適宜用量范圍；再根據單因素試驗結果，選用合適的正交試驗設計表對5個因素的用量組合進行進一步優化，以確定適合國槐的10μL SSR-PCR最佳反應體系。

表3 國槐SSR-PCR反應體系單因素試驗因素及水平

1．2．4 PCR優化體系的驗證 隨機挑選出8個國槐種質和4對SSR引物，利用篩選出的最佳反應體系進行PCR擴增，通過對擴增結果的分析對PCR反應體系進行有效驗證。如果擴增出的條帶清晰、穩定，則表明試驗確定的反應體系適宜國槐SSR-PCR反應。

2 結果與分析

2．1 國槐DNA提取質量檢測

經紫外分光光度計檢測，提取的國槐基因組DNA的OD260/OD280值在1．7～2．0之間；經0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），條帶清晰完整且無明顯的拖尾。說明提取的DNA樣品濃度和純度較高，足以滿足后續試驗的要求。

M為DL15000 DNAMarker；1～9分別代表國槐種質WF56、TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396的基因組DNA。

2．2 單因素試驗結果與分析

2．2．1 Mg2+用量對國槐SSR-PCR反應的影響

在PCR反應體系中，Mg2+與dNTPs相互作用影響酶的活性，進而影響PCR擴增效果［11］。Mg2+濃度過高會降低PCR擴增的特異性，濃度過低則可能使PCR擴增產物量減少甚至擴增不出條帶［12］。如圖2所示，Mg2+用量為0．2μL時未擴增出條帶，用量為0．5μL時擴增出的條帶較弱；用量為1．0～2．5μL時均擴增出清晰條帶，但隨著Mg2+用量的增加，條帶的背景也呈逐漸加深趨勢。綜合考慮，Mg2+用量1．0μL較為適宜，擴增出的條帶清晰且無明顯背景。基于此，選擇0．5～2．0μL的Mg2+用量用于后續正交試驗分析。

2．2．2 引物用量對國槐SSR-PCR反應的影響

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指25 mmol/L Mg2+用量為0．2、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5μL。

引物濃度是影響PCR擴增結果的重要因素，濃度較低時很難進行有效擴增，往往擴增不出目的條帶，而濃度過高則很容易引起錯配或擴增出很多非特異性條帶［11］。由圖3可以看出，當引物用量在0．2μL時，擴增條帶較弱，當引物用量達0．5 μL時，條帶明顯清晰，隨著引物濃度的不斷增加，條帶的清晰度不斷增加，但也逐漸出現彌散現象。因而用量最少且又擴增出清晰條帶的0．5μL為引物適用量，并選擇引物0．2～1．5μL用量范圍用于正交試驗分析。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指10μmol/L引物用量為0．2、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5μL。

2．2．3 dNTPs用量對國槐SSR-PCR反應的影響 dNTPs的濃度與PCR擴增效率有密切關系，濃度過低，PCR產物的產量減少，擴增出的條帶不清晰；濃度過高，則會與Mg2+結合，降低游離Mg2+濃度，從而使酶的聚合效率降低，影響擴增結果［13］。由圖4可知，當dNTPs用量在0．1μL時，擴增出的條帶較弱，從0．2μL開始均擴增出清晰條帶，且之后變化不大，因而0．2μL為較佳的dNTPs用量，選擇0．2～0．8μL dNTPs用于正交試驗分析。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指2．5 mmol/L dNTPs用量為0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0μL。

2．2．4 ExTaq酶用量對國槐SSR-PCR反應的影響 ExTaq酶是PCR反應的關鍵，但濃度較高時會使非特異性產物增加，而濃度較低時則會使擴增量不足，擴增出的條帶較弱［11］。由圖5可以看出，ExTaq酶用量在0．01、0．02μL擴增出的條帶微弱，用量繼續增加，條帶逐漸清晰，但同時背景也在逐漸加深。綜合考慮，可以選擇擴增條帶清晰且無明顯背景的0．05μL作為適宜的ExTaq酶用量。基于此，選擇0．02～0．15μL ExTaq酶設計正交試驗。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指5 U/μL ExTaq酶用量為0．01、0．02、0．05、0．10、0．15、0．20μL。

2．2．5 模板DNA用量對SSR-PCR反應體系的影響 如圖6所示，模板DNA用量為5 ng和15 ng時，擴增出的條帶極其微弱；當用量增加到30 ng時，能擴增出清晰的條帶；用量為50、70 ng時，條帶清晰度相對于30 ng時有所增加，但無較大區別；當用量增加到90 ng時，條帶出現較弱的虛化現象。因而模板DNA用量為30 ng時較為適宜，在此基礎上選擇15～70 ng模板DNA用于后續正交試驗設計。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指模板DNA用量為5、15、30、50、70、90 ng。

2．3 正交試驗結果

根據單因素試驗選擇的各因素用量范圍，設計5因素4水平正交試驗，選用L16（45）正交表設計因素組合（表4），然后利用引物2114對國槐WF56進行PCR擴增。

電泳結果（圖7）顯示，不同因素組合的PCR擴增結果存在較大差異，其中，組合1、2、12未擴增出條帶，組合3、4擴增出的條帶較弱，其余組合均擴增出清晰的條帶。

M為DL500 DNA Marker；1～16指正交試驗設計的16個處理組合。

依據擴增出的特異條帶清晰度并結合背景深淺進行打分，條帶最清晰且無明顯背景的打16分，以此類推，得到16個組合的分值依次為3、3、4、5、7、16、14、13、9、15、10、3、6、8、11、12，然后對同一因素相同水平下的分值平均值Xi（i＝1，2，3，4，表示4個不同水平）以及各因素的極差R進行計算［14］，結果（表4）顯示，Mg2+用量對SSRPCR反應體系的影響最大，其次為引物和dNTPs，ExTaq 酶 和 模 板 DNA 影 響 較 小；組 合A2B2C1D4E1，即Mg2+用量1．0μL、引物用量0．5 μL、dNTPs用量0．2μL、ExTaq酶用量0．15μL、模板DNA用量15 ng時PCR擴增效果最好。

但由于ExTaq酶和模板DNA對SSR-PCR擴增結果的影響相對較小，結合單因素試驗結果，綜合考慮。最終確定含有Mg2+1．0μL、引物0．5 μL、dNTPs 0．2μL、ExTaq酶0．05μL、模板DNA 30 ng的PCR反應體系（10μL）最優。

2．4 優化反應體系的驗證

利用8個國槐種質TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396和4對引物1302、1970、2541、3049對試驗獲得的最佳反應體系進行驗證。結果（圖8）顯示，每對引物均擴增出清晰穩定的條帶，其中引物1302和3049擴增出了多樣性條帶。表明上述試驗確定的反應體系穩定、可靠，可用于國槐SSR標記開發及遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建等研究中。

表4 國槐SSR-PCR反應體系優化的L16（45）正交試驗設計及直觀分析結果

M指DL500 DNA Marker；1～8分別代表國槐種質TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396。

3 討論與結論

PCR擴增是SSR分子標記實驗的重要環節，可靠的PCR反應體系是開發和利用SSR標記的基礎［15］。優化PCR反應體系，篩選最優因素組合，可以有效降低非特異性擴增，提高PCR擴增效率［16］。

單因素試驗結合正交試驗的方法能用較少的試驗處理獲得較好的試驗結果，大大減少工作量。如利用該方法，宋偉栓［17］確立了適用于國槐SRAP的PCR反應體系，王健兵等［18］優化了白蠟SSR-PCR反應體系，趙克奇等［14］建立了適用于刺槐EST-SSR標記的PCR反應體系。

本研究利用單因素試驗與正交試驗相結合的方法對國槐SSR-PCR反應體系中的Mg2+、dNTPs、引物、ExTaq酶、模板DNA用量進行了優化，最終得到最佳反應體系（10μL）：25 mmol/L Mg2+1．0μL，2．5 mmol/L dNTPs 0．2μL，10μmol/L上下游引物共0．5μL，5 U/μL ExTaq酶0．05μL，30 ng/μL DNA模板1．0μL，10×PCR Buffer 1．0μL，ddH2O 6．25μL。并選用4對引物、8個國槐種質對該PCR反應體系的擴增效果進行驗證，結果表明在該反應體系下均能擴增出清晰、穩定的多態性條帶。本試驗結果為利用SSR標記深入研究國槐種質資源奠定了基礎。