支氣管敗血波氏桿菌PRN基因CDS區的生物信息學分析

宋吉健 王怡滌 楊金錢 李夢云 劉志軍 趙戰勤

摘要：通過生物信息學軟件預測分析支氣管敗血波氏桿菌PRN基因編碼蛋白功能及其調節機制。結果表明，支氣管敗血波氏桿菌PRN基因CDS區編碼911個氨基酸，分子式為C4 121H6 556N1 250O1 258S11，分子質量為13 196，消光系數為95 800，其理論等電點為9.64，不穩定系數為36.24，PRN蛋白的理化性質穩定;PRN蛋白有多個磷酸化位點和糖基化位點;信號肽預測PRN蛋白有1個信號肽，信號肽位置在1～34;PRN蛋白為親水性蛋白，存在1個跨膜結構;預測二級結構主要由無規則卷曲構成，占39.08%，β-折疊占23.93%，α-螺旋占23.30%，三級結構主要由無規則卷曲和β-折疊構成。上述結果提示，該蛋白具有重要生物學意義，可為進一步開發支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗奠定基礎。

關鍵詞：支氣管敗血波氏桿菌;PRN;CDS區;生物信息學

中圖分類號：S855.1+2 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0052-06

支氣管敗血波氏桿菌是一種引起呼吸道感染的革蘭氏陰性細菌，它是多種哺乳動物的天然病原體[1]。波氏桿菌為波氏桿菌屬，波氏桿菌屬目前包括16個已命名的菌種：百日咳波氏桿菌（Bordetella pertussis）、副百日咳波氏桿菌（B. parapertussis）、支氣管敗血波氏桿菌（B. bronchiseptica）、禽波氏桿菌（B. avium）和其余菌種，后幾種由于發現較晚，所以研究相對較少[2]。目前，研究較多的主要為前3種，與人類和其他哺乳動物的呼吸道感染有關，因而稱為“經典波氏桿菌”[3-4]。近年來，大量研究發現波氏桿菌在世界范圍內的豬、兔、犬及貓中廣泛存在，協同感染非常嚴重，給畜牧業造成巨大的經濟損失[5]。目前，研究者們通過多種方法運用基因技術，研發新型的亞單位疫苗，但大多還未大批量投入生產。

支氣管敗血波氏桿菌pertactin（PRN）是一種外膜蛋白，從細菌表面突起的長線型蛋白非常適合促進細胞間的黏附，由92 ku PRN前體蛋白分解產生，表觀分子量在支氣管敗血桿菌中為68 ku，在百日咳桿菌中為69 ku，在副百日咳桿菌中為70 ku[6]。大量研究表明，缺失PRN的Bb菌株不能引起豬的發病，且豬群保護率與PRN為線性關系，表明PRN作為支氣管敗血波氏桿菌的主要保護性抗原[7]。因此，本研究通過生物信息學分析深入研究該基因，以期為進一步研發波氏桿菌新型疫苗的研發提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

NCBI數據庫公布的支氣管敗血波氏桿菌PRN基因（GenBank No：AJ245927）序列共含911 個氨基酸，序列如下：MNMSLSRIVKAAPLRRTTLAMALGALGAAPAAYADWNNQSIIKAGERQHGIHIKQSDGAGVRTATGTTIKVSGRQAQGVLLENPAAELRFQNGSVTSSGQLFDEGVRRFLGTVTVKAGKLVADHATLANVSDTRDDDGIALYVAGEQAQASIADSTLQGAGGVRVERGANVTVQRSTIVDGGLHIGTLQPLQPEDLPPSRVVLGDTSVTAVPASGAPAAVSVFGANELTVDGGHITGGRAAGVAAMDGAIVHLQRATIRRGDAPAGGAVPGGAVPGGFGPLLDGWYGVDVSDSTVDLAQSIVEAPQLGAAIRAGRGARVTVSGGSLSAPHGNVIETGGGARRFPPPASPLSITLQAGARAQGRALLYRVLPEPVKLTLAGGAQGQGDIVATELPPIPGASSGPLDVALASQARWTGATRAVDSLSIDNATWVMTDNSNVGLRLSDGSVDFQQPEGRFKVLMVDTLGSGLFRMNVFDLGLSDKLVVMRDSGQHRLWVRNSGSEPSNTMLLVQTPRGSTFTLNKDGKVDIGTYRYRLNGNGQWSLVGKPPPKPPQPGPQPGPQPPQPPQPPQPPQRQPEPPQPPGRELSNVNTGGVGLSTLWYESNLSKRLGELRLNPDGGWGRGFQRQQLDNRGRRFDQKVGFELGDHVVGGRWHLGGLGYTRGDRGFTGDGGGHTDSVHVGGYTYINSGFYLDTLRSRLENDFKVGSDGYVKGKYRTHGVGSLEGRRFHDGWFLEPQELVFRVGGGSYRNGLRVRDEGGSSVLGRLGLEVGKRIELGGRQVQPYIKSVLQEFDGGTVRTNGIHRTELRGTRELGLGMLGRGHSLYSYEYSKGPKLMPWTFHGYRYSW。

1.2 方法

利用ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測分析PRN蛋白的親水性、等電點、半衰期、穩定性等理化性質，利用Net Phos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）使用YinOYang 1.2 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）和NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/.）PRN蛋白綜合分析磷酸化和N、O這2種糖基化;利用PSORTb version 3.0.2 （http：//www.psort.org/psortb/results.pl）和LocTree3（https：//rostlab.org/owiki/index.php/Loctree3）分析PRN的亞細胞定位和預測。對PRN蛋白的保守結構域分析使用NCBI的CDD程序（https：//www. ncbi. nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）;用TMHMM軟件（http：//www. cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和使用SignalIP 5.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）對PRN氨基酸序列進行跨膜區和信號肽預測分析;利用NPS@中SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSAHLP/npsahlp_secpredsopma.html）分析軟件對PRN蛋白的二級結構進行分析;PRN蛋白三級結構的預測在 SWISS-MODEL程序進行（https：//swissmodel.expasy.org/）。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

利用ExPASy-ProtParam 對PRN蛋白質的理化性質進行預測，結果表明，PRN 蛋白包含911 個氨基酸，其中，Ala（14.3%）、Gly（14.3%）和Leu（88%）出現頻率較高，帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）有75個，頻率為8.2%;帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）有89個，頻率為9.8%（表1）。PRN蛋白分子式為C4 121H6 556N1 250O1 258S11，分子質量為13 196，消光系數為95 800 L/（mol·cm），其理論等電點（pI）為9.64;其不穩定系數為36.24（<40），屬于穩定類蛋白質;親水性平均系數（GRAVY）為-0.201，為親水性蛋白。預測在哺乳動物網織紅細胞（體外）中的半衰期為30 h，在酵母（體內）中的半衰期>20 h，在大腸桿菌（體內）中的半衰期>10 h。

2.3 疏水性分析

利用Protscale中Kyte & Doolittle 對PRN 蛋白的疏水性進行預測（window size=9），由圖1可知，該蛋白最大疏水性區域為23、875位氨基酸區域，均為1.989;在589、591位氨基酸區域為最小疏水區，均為-2.767。平均疏水指數（GRAVY）為-0.201，即為親水性蛋白。

2.3 跨膜結構和信號肽預測

利用TMHMM軟件對PRN氨基酸序列進行跨膜區預測分析，跨膜區位于17～34氨基酸之間，由圖2可知，與使用Protscale中Kyte & Doolittle分析的最大疏水區域第23位氨基酸的位置相一致。對序列跨膜區預測是十分必要的。通常，膜蛋白不能在原核表達系統中表達，如果對序列進行跨膜區預測發現序列中存在跨膜區，則在后續需要選擇真核表達系統進行表達;如果想利用原核表達系統進行表達，需要對跨膜區序列進行刪除。利用SingaIP 41軟件分析發現有一個信號肽，由圖3可知，信號肽類型為SP（Sec/SPI）;信號肽位置為1～34;信號肽序列為MNMSLSRIVKAAPLRRTTLAMALGALGAAPAAYA。通過預測跨膜區和信號肽，可進行原核表達時去除其信號肽， 對PRN進行克隆表達， 為進一步開發亞單位疫苗奠定基礎。

2.4 PRN蛋白磷酸化、糖基化位點

利用Net Phos 3.1、YinOYang 1.2 Server和NetNGlyc 1.0 Server蛋白綜合分析磷酸化和糖基化位點，由圖4可知，磷酸化位點較多;糖基化分析結果（圖5）表明，與N-連接的糖基化有6個，在2、38、92、129、170、428，與O-連接的糖基化18個（圖6），在68、72、151、172、207、209、214、221、291、320、322、415、418、506、617、631、902、910，其中，序列位置214和631嚴重糖基化。

2.5 PRN亞細胞定位分析

利用PSORTb version 3.0.2和LocTree3分析PRN的亞細胞定位。PRN的亞細胞定位分數分別為細胞質0.00、細胞質膜0.00、周質0.00、外膜1000、細胞外0.00。定位分數顯示，PRN定位在細菌的細胞外膜中，利用LocTree 3分析PRN的亞細胞定位。由圖7可知，PRN定位在細胞外膜中，亞細胞定位分數為0.95，精確度為98%。基于上述2種在線軟件的亞細胞定位預測結果表明，PRN 定位在細胞外膜中。

2.6 蛋白結構

通過NCBI的CDD 程序分析發現，PRN蛋白存在2個保守域結構，分別命名為TIGR01414和cd01343，TIGR01414是主要在病原體中發現并與毒力相關，參與細胞黏附，在氨基酸458～911間包含1個保守的C端結構域，自動轉運蛋白結構域的長度約為 400 個氨基酸，包括富含芳香族氨基酸的 OMP 信號，還是cl36898超家族唯一成員。cd01343位于氨基酸317～559間，是革蘭氏陰性菌 V 型分泌系統的自轉運蛋白。cd01343是超家族cl00185的成員。PRN蛋白由16股平行的β螺旋氨基酸結構組成，呈“V”形橫截面，是迄今為止已知的最大的β螺旋蛋白之一。

使用SOPMA分析軟件對PRN蛋白的二級結構進行分析，由圖8可知，PRN蛋白二級結構中主要以α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規則卷曲構成，分別占23.30%、13.61%、23.93%和39.08%。運用SWISS-MODEL軟件完成PRN蛋白三級結構模型的構建（圖9）。觀察到較多的無規則卷曲和α-螺旋，與二級預測結果相一致。但GMQE評價模型可靠性得分為0.42，表明該模型可信度一般。

3 討論

目前，支氣管敗血波氏桿菌主要在豬、犬、兔等動物群體間感染非常嚴重，長期以來危害被低估[8]。尤其在豬群中與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌等協同感染嚴重，死亡率很高，給養殖業帶來巨大的損失[9]。雖然Bb主要是佐劑滅活苗已在世界范圍內廣泛應用，但免疫效果普遍較差，豬群對于支氣管敗血波氏桿菌的攜帶十分嚴重[10]。此外，大量抗生素的使用加劇了細菌耐藥性的產生[11]。相關研究表明，使用豬支氣管敗血波氏桿菌某些表面毒力因子及相關分泌蛋白作為亞單位疫苗，對于豬波氏桿菌病感染具有一定的免疫保護作用[12]。研究人員發現，除去N端信號肽的PRN基因，在大腸桿菌中實現了各段基因的高效表達[13]。結果表明，蛋白片段氨基酸序列保守、表達量高、純化方便，可作為亞單位疫苗進行開發。本研究通過生物信息學軟件對PRN分析，它編碼由911個氨基酸組成、理論等電點為9.64的親水性蛋白，根據結構與生物特性預測結果分析，PRN包含2個RⅠ（GGXXP）n和 RⅡ（PQP）n 重復氨基酸序列，研究發現RⅠ區可能與細菌的黏附功能有關，RⅡ為主要的保護性抗原表位[14]。PRN還具有逃避宿主細胞的免疫保護作用，對巨噬細胞可能有一定的毒性[15]。

趙戰勤等曾克隆表達出PRN及其不同區域的氨基酸多肽，通過小鼠免疫保護試驗證明了PRN的N端強于C端，且RⅡ區域強于RⅠ區域[16]，但其僅在小鼠模型進行了免疫保護試驗，未在豬群進一步驗證，無法確定是否對豬也具有較好的免疫保護性。此外，在設計引物進行PCR擴增時會出現擴增不出目的條帶的現象，或者克隆出PRN基因片段在測序時也會出現不同的問題，這可能是波氏桿菌基因GC含量過高，尤其PRN基因GC含量高達716%。有研究發現在擴增PRN基因時加入少量的二甲基亞砜（DMSO）或betaine[17]，使其氫鍵斷裂有利于雙鏈解開，因此對該基因還需要進一步研究。最近科學研究發現不表達PRN基因的陰性菌株越來越多，一些重要基因（包括毒力相關基因或調節基因）上的單核苷酸多態性（SNP）可能幫助機體在疫苗選擇壓力下存活[15]，這也是為什么最近幾年百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌在全球廣泛傳播，從未消退，研發新型疫苗刻不容緩。其次，在進行同源性分析時，發現禽波氏桿菌（B. avium）基因中沒有PRN基因，這也可以證明禽波氏桿菌與百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌不屬于同一個群。而且發現支氣管敗血波氏桿菌在一個支上，PRN基因同源性較高，可為研究新型疫苗的研發提供一個新思路。李洪廣等發現兔支氣管敗血波氏桿菌缺失PRN基因可以使毒力下降，突變株產生了較好的免疫原性，進行減毒活疫苗的研發也是一種新思路[18]。

本研究通過對編碼的PRN蛋白進行了較全面的生物信息學分析，預測分析了該蛋白的氨基酸同源性、理化性質、生物學特性及功能，研究其信號肽和功能域，預測該蛋白二級結構和三級結構，可為進一步研究其功能、調節機制及相關支氣管敗血波氏桿菌疫苗提供借鑒。

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