食用檳榔廢棄籽的活性成分提取及抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

張培月，唐敏敏，宋 菲，劉 璨，陳 華,3,

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070；2.中國熱帶農業科學院椰子研究所，海南文昌 571339；3.海南省檳榔產業工程研究中心，海南文昌 571339）

檳榔是一種棕櫚科常綠喬木植物的果實，可藥用和食用[1]。全球檳榔生產與消費有3000年歷史，目前，世界上有十分之一的人嚼食檳榔[2-3]。在我國，檳榔主要有兩種食用方式，一種是鮮食，即把檳榔鮮果切開后，包上涂有貝殼粉的蔞葉直接嚼食；另一種食用的是加工后的檳榔干果[4]。海南省是我國檳榔種植規模最大的省份，2019年末全省檳榔面積超過11.51萬 hm2，總產量超過28.70萬噸，檳榔已成為海南230萬農民的主要經濟來源[5]。湖南省是我國食用檳榔的主要加工省份，加工食用檳榔已成為中國食品加工的一大產業，其消費已經遍布全國各地，2019年全國檳榔產業年產值超過400億元，帶動物流、包裝、食品添加劑等相關產業產值超500億元[6]。檳榔廢籽由檳榔鮮果經過多個加工工藝加工后切開除籽而來，據統計，食用檳榔每年加工剔除的檳榔籽多達35000噸，被剔除的檳榔籽一般被當做廢棄物處理，基本被焚燒，甚至丟棄，既污染環境，又造成了資源浪費。

檳榔含有多種活性成分，對于檳榔中多酚[7-8]和生物堿[9-10]等活性成分的功效功能已有較多研究。檳榔堿是檳榔的主要藥用成分之一[11]。有研究表明，一定含量的生物堿可以增加小鼠腦中乙酰膽堿的濃度，激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸[12]，改善老年性癡呆癥[13]，明顯地增強小鼠腸道和離體腸蠕動，興奮胃腸道平滑肌，影響離體豚鼠回腸自發收縮，檳榔堿還可在一定程度上對抗血栓形成[14]，抗炎[11]和抑制骨質疏松[15]。也有研究指出，檳榔生物堿有致口腔粘膜下纖維性變、損害神經系統和生殖系統等的作用[16]。黃酮類化合物被證明有抗氧化的作用[17-18]，韓林等發現未經加工的檳榔籽提取物具有抗氧化活性，且抗氧化活性的大小與總酚的含量及組成有關[19]，宋菲等認為未經加工的檳榔籽多酚提取物具有降血糖功能[20]，張璐等檢測到經初加工的檳榔籽提取物具有抗氧化能力[21]，而對于檳榔廢籽的活性成分含量、抗氧化活性和降血糖功能的系統研究較少。

因此，本文以食用檳榔廢籽為研究對象，以75%乙醇為提取溶劑進行超聲輔助提取，測定了其總多酚、總黃酮、原花青素含量及檳榔生物堿等活性成分，檢測了部分黃酮組分，并且利用體外抗氧化評價體系和降血糖評價體系對其進行抗氧化能力和降血糖能力研究，以期為檳榔廢棄籽的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檳榔廢棄籽 某食用檳榔加工企業提供；L-抗壞血酸（維生素C） 上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸、蘆丁和兒茶素等標準品、α-葡萄糖苷酶（來源于釀酒酵母，14.5 U/mL） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、阿卡波糖 北京索萊寶科技有限公司；2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+） 上海阿拉丁生化科技有限公司；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

A11BS25 高速中藥粉碎機 德國IKA 公司；ALLPSE-40 超聲波清洗機 深圳市超藝達科技有限公司；AL204-IC 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-98-11A 電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；Varioskan Flash 全波長多功能酶標儀 美國 Thermo 公司；MVA15G0014 紫外可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；DP-406DG 真空冷凍干燥機 無錫德普儀器制造有限公司；ExionLC AD超高效液相、QTrap 6500高靈敏度質譜 美國應用生物系統公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檳榔廢棄籽活性物質提取 清除雜物后，將檳榔廢籽60 ℃低溫烘干，然后用高速中藥粉碎機粉碎，以75%的乙醇作為提取溶劑，超聲輔助提取。料液比1:10 （g/mL），超聲波頻率40 kHz，提取3次每次30 min，400 目紗布過濾，合并濾液，1500 r/min，離心30 min，收集上清液，低溫旋蒸除去乙醇后冷凍干燥。取適量提取物溶于甲醇，得到200 mg/mL的儲備液，過0.20 μm的微孔濾膜后存于-20 ℃備用。

1.2.2 活性成分含量測定

1.2.2.1 總多酚含量的測定 總多酚含量的測定采用福林酚氧化法[22]。在波長765 nm處測定吸光值，用甲醇溶液作為空白對照，以濃度C（Y，μg/mL）對吸光值（X）作圖，得到沒食子酸的標準曲線。沒食子酸濃度C=86.966×A765-7.0379，R2=0.9987。樣品按照相同的方法測定其吸光值，總多酚含量以每克提取物中的沒食子酸含量計。

1.2.2.2 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[22]。在波長510 nm處測吸光值，用甲醇溶液作為空白對照，以濃度C（Y，μg/mL）對吸光值（X）作圖，得到蘆丁的標準曲線。蘆丁濃度C=296.84×A510-15.207，R2=0.9987。樣品按照相同的方法測定其吸光值，總黃酮含量以每克提取物中的蘆丁含量計。

1.2.2.3 原花青素含量的測定 原花青素含量的測定采用香草醛-鹽酸法[23]，于暗處反應30 min，然后在波長510 nm處測吸光值，用甲醇溶液作為空白對照，以濃度C（Y，μg/mL）對吸光值（X）作圖，得到兒茶素的標準曲線。兒茶素濃度C=415.1×A510-15.304，R2=0.9994。樣品按照相同的方法測定其吸光值，原花青素含量以每克提取物中的兒茶素含量計。

1.2.2.4 黃酮類化合物組分測定 黃酮類化合物組分測定測定參照文獻[24]。

黃酮類化合物提取：取10 mg PSE加入5 mL離心管，加入2000 μL提取液A（75%甲醇含1%乙酸）渦旋30 s后冰水浴超聲60 min后，12000 r/min離心15 min；取1500 μL上清液氮氣吹干，加入1500 μL提取液B（50%甲醇含0.1%甲酸）復溶；渦旋30 s后冰水浴超聲15 min，12000 r/min離心15 min；取上清于2 mL進樣瓶上機檢測。

色譜條件：色譜柱：ACQUITY ULC BEH C18色譜柱（1.7 μm×21 mm×150 mm）；柱溫箱溫度設為40 ℃，自動進樣器溫度設為8 ℃，進樣體積為2 μL。液相色譜流動相，A：0.1%甲酸水溶液；B：100%乙腈；總流速為300 μL/min；流動相B梯度洗脫程序為：0～0.50 min，0%～10%；0.51～15.00 min，10%～60%；15.01～18.00 min，60%～98%；18.01～20.00 min，98%～10%。

質譜參數：數據采集時，以多反應監測（MRM）模式進行質譜分析。離子源參數如下：離子噴霧電壓，+5000/-4500 V；氣簾氣壓力，35 Psi；溫度，500 ℃；離子源氣體壓力1，55 Psi；離子源氣體壓力2，60 Psi。

1.2.3 抗氧化能力的測定

1.2.3.1 DPPH清除率測定 參照文獻[25]，在暗處反應20 min后用酶標儀在波長492 nm處測吸光值。以甲醇作為空白對照，以VC溶液作為陽性對照，按照以下公式計算清除率：

式中：A樣品為樣品與DPPH 反應后的吸光值，A對照為樣品本身的吸光值，A空白為DPPH本身的吸光值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除率測定 參照文獻[25]，取10 μL不同濃度的樣品與200 μL 0.1 mmol/L的ABTS自由基工作液添加到96微孔板中，用酶標儀測在734 nm處測吸光值。以甲醇作為空白對照，VC溶液作為陽性對照，按照以下公式計算清除率：

式中：A樣品為樣品與ABTS反應后的吸光值，A對照為樣品本身的吸光值，A空白為ABTS本身的吸光值。

1.2.3.3 還原力測定 參照文獻[26]，取1 mL樣品，先后向其中加入2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，于50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸以及0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻，靜置10 min，于700 nm測吸光值，以超純水為空白調零，VC溶液為陽性對照，吸光值越高，表明抗氧化效果越好。

1.2.4α-葡萄糖苷酶活力抑制試驗 參照文獻[27]，取0.4 mL濃度為0.04 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液（由0.1 mol/L的pH6.8磷酸鹽緩沖溶液稀釋配制而成）和不同濃度的樣品于試管中，37 ℃水浴5 min，然后加入0.2 mL物質的量濃度為0.5 mmol/L的pNPG溶液，混勻，37 ℃水浴反應30 min后加入0.5 mL物質的量濃度為0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應。室溫靜置5 min后，于波長405 nm處測吸光值。如表1所示，以適當濃度的阿卡波糖溶液作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖溶液作為空白調零。每組作3次平行重復，取平均值，按照以下公式計算清除率：

表1 α-葡萄糖苷酶活力抑制試驗反應體系Table 1 Experimental reaction system of α-glucoside enzyme vitality inhibition experimental reaction system

式中：A0、A1、A2、A3分別表示空白對照管、樣品管、樣品對照管、對照管的吸光值。

1.3 數據處理

所有試驗數據均為3次平行試驗，測試結果以平均值±標準偏差來表示。用Excel 2019 軟件和SPSS 26.0軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 生物活性物質含量分析

2.1.1 生物活性物質總含量 由表2可知，PSE的總多酚含量為（127.29±5.16） mg/g，總黃酮含量較高，為（421.84±13.82） mg/g，而且含有一定的原花青素，其含量為（87.83±6.60） mg/g。

表2 檳榔廢棄籽中總多酚、總黃酮和原花青素的含量Table 2 Total polyphenols, total flavonoids and progesterone content in processed betel nut seeds

由于提取方法的不同，所得樣品中的檳榔生物活性成分的含量也有所不同。張丹等[28]以海南9月份的新鮮檳榔果為試驗材料，用70%的乙醇提取后又分別萃取了其乙酸乙酯部位和正丁醇部位，檳榔提取物乙酸乙酯部位總多酚含量（7.47±0.047） mg/g和總黃酮含量（121.25±1.25） mg/g均大于正丁醇部位的總多酚含量（4.91±0.034） mg/g和總黃酮含量（34.07±0.88） mg/g，均小于本試驗PSE的總多酚含量（127.29±5.16） mg/g和總黃酮含量（421.84±13.82）mg/g。而唐敏敏等[29]通過對成熟檳榔果的檳榔籽研究得出，總多酚和原花青素的含量從大到小依次為：正丁醇部位＞乙酸乙酯部位＞乙醇提取物＞水相＞石油醚部位，總黃酮含量從大到小依次為：乙酸乙酯部位＞水相＞正丁醇部位＞乙醇提取物＞石油醚部位。

另外，不同的加工方法對活性物質的影響也有所不同。袁源等[25]對經過不同炙法加工方式的檳榔果皮進行了研究，結果表明：經過不同炙法加工后總黃酮的含量、總酚和鞣質的含量均高于空白組（獲得新鮮果皮后不進行任何加工，只低溫烘干而來），其中空白組總黃酮含量為（3.76±0.62） mg/g，總酚含量為（3.91±0.78） mg/g。總黃酮含量以姜炙法得到的樣品最高，其含量為（6.96±0.36） mg/g，酒炙法次之，其含量為（5.50±0.47） mg/g，干炙法和甘草炙法稍好，其含量分別為（4.29±0.81）和（4.12±0.93） mg/g。總酚含量也以姜炙法得到的樣品最高，其含量為（8.54±0.69） mg/g，其他加工方法所得提取物的總酚含量從高到低依次是酒炙法，其含量為（7.53±0.41） mg/g，干炙法，其含量為（5.18±0.32） mg/g，甘草炙法，其含量為（4.77±0.62） mg/g。鞣質含量的趨勢與總黃酮和總酚一致。

2.1.2 黃酮類化合物組分相對含量測定 黃酮類化合物（flavonoids）又名類黃酮，泛指2個芳香環（A環和B環）通過中央3個碳原子聯接而成的一系列化合物，基本骨架為C6-C3-C6。黃酮類化合物分為二氫黃酮（2H-flavanones）、黃酮（flavones）、異黃酮（isoflavones）、黃酮醇（flavonols）、黃烷醇（flavanols）和花色素六大類（anthoyanidins）[30-31]。對多種細菌、真菌、病原體等致病微生物有抑制作用[32]，同時具有擴張血管、降糖降脂、美白等功效，有較高的實用開發價值[33]。由表2可知，總黃酮的含量最高，為明確PSE中各黃酮類化合物組分的相對含量，本實驗篩選了86種黃酮類化合物作為標準品，對PSE中的黃酮類化合物組分進行靶向定性鑒定。結果表明，從PSE中共鑒定出44種黃酮類化合物，表3列出了20種相對含量大于0.10%的黃酮類化合物，其中兒茶素的含量最高，為77.27%，其次為表兒茶素（8.53%）、原花青素 B1（4.66%）、原花青素 B2（3.45%）等。原花青素又稱縮合單寧，其基本組成單元被稱為單倍體，一般指兒茶素和表兒茶素[34]，已有研究表明這些物質具有多種藥理活性，是天然的自由基清除劑和抗氧化劑，具有抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、抗癌變，預防心腦血管疾病，預防動脈粥樣硬化等功能[35-36]。

表3 PSE中的類黃酮組分相對含量Table 3 Relative contents of flavonoids in PSE

2.2 抗氧化能力

2.2.1 對DPPH自由基的清除作用 由圖1可以看出，在實驗濃度范圍內，PSE對DPPH自由基的清除能力與濃度呈正相關，即隨著濃度的增加而增強。從總體上看，在任何一個相同濃度下，陽性對照VC的清除能力均強于PSE。當濃度范圍是0～1000 μg/mL時，PSE的DPPH自由基清除率隨濃度急劇增大，隨后再增加濃度，清除自由基的能力基本不變。當濃度范圍是10～200 μg/mL時，PSE和VC清除DPPH自由基的能力相差越來越大，然后隨著濃度的增加，兩者清除效率的差距逐漸變小，最終趨于不變。PSE的DPPH自由基清除能力（IC50值為（310.10±0.62）μg/mL）弱于陽性對照組VC（IC50值為（177.53±0.89）μg/mL），約是VC的二分之一，且具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖 1 PSE和VC對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Ability to scavenge DPPH radicals of PSE and VC

Lin等[37]評價了產于海南檳榔果的種子清除DPPH自由基能力，結果顯示，當提取物濃度為200 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為60.37%。而本試驗的PSE濃度為200 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為28.34%。由此可以看出，檳榔廢棄籽雖然清除DPPH自由基能力相對較弱，但是仍然擁有一定的清除能力。張丹等[28]研究結果表明，新鮮檳榔籽乙酸乙酯部位和正丁醇部位均有一定的DPPH自由基清除能力，IC50值分別為14.60和44.32 μg/mL，均強于本試驗PSE的DPPH自由基清除能力（IC50值為310.10 μg/mL）。

由以上結果可以看出，不同的提取方法和不同的萃取部位均會對檳榔的清除DPPH自由基的能力產生不同程度的影響。新鮮檳榔在被加工成食用檳榔的過程中需要經過多個加工環節，而殺青、發籽等工藝的高溫和浸泡的工藝條件對檳榔籽中的抗氧化成分造成了流失或分解，從而使PSE的抗氧化作用相對減弱。

2.2.2 對ABTS+自由基的清除作用 由圖2可以看出，在實驗濃度范圍內，PSE對ABTS+自由基的清除能力與濃度呈正相關，即隨著濃度的增加而增強。從總體上看，在任何一個相同濃度下，陽性對照VC的清除能力均強于PSE。當濃度范圍是0～200 μg/mL時，PSE對ABTS+自由基清除率均隨濃度的增大而急劇增大，隨后再增加濃度，清除率幾乎不變，當濃度是600 μg/mL時，PSE對ABTS+自由基的清除能力幾乎達到100%。PSE的ABTS+自由基清除能力（IC50值為（150.10±11.57） μg/mL）弱于陽性對照組VC（IC50值為（64.12±2.55） μg/mL），約是VC的二分之一，且具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖 2 PSE和VC對ABTS+自由基的清除能力Fig.2 Ability to scavenge ABTS+ radicals of PSE and VC

Lin等[37]對產于海南檳榔果的種子清除ABTS+自由基能力進行了研究，當濃度為100 μg/mL時，PSE對ABTS+自由基的清除率為42.20%。本實驗結果表明，當提取物濃度為100 μg/mL時，對ABTS+自由基的清除率為45.27%，與本實驗PSE對ABTS+自由基的清除能力差異不大。由此可見，加工后的檳榔籽與鮮果的檳榔籽相比，對ABTS+自由基的清除能力幾乎沒有減弱。而且，加工后的檳榔籽對ABTS+自由基的清除能力（IC50值為（150.10±11.57） μg/mL）相比于對DPPH自由基的清除能力（IC50值為310.10 μg/mL）較強。

2.2.3 還原Fe3+的能力 還原能力與抗氧化活性有一定的相關性，因此還原能力的測定常用于評價抗氧劑活性，而且這種方法的測定結果反映的不是針對某一種自由基的清除效果，而是被測物的總抗氧化能力，已經被應用于測定多種抗氧化物質[38]。抗氧化劑將鐵氰化鉀中的三價鐵還原為二價鐵離子，二價鐵離子進一步生成普魯士蘭，其在700 nm處有最大吸收波長。因此在700 nm下的吸光值越高，表明該抗氧化劑的還原力越高，抗氧化性越強。由圖3可以看出，在實驗濃度范圍內，PSE的還原能力總體低于VC，但是兩者相差不大，尤其是200～2200 μg/mL的濃度范圍內。由圖3可以看出，在10～200 μg/mL濃度范圍內，隨濃度的增加，兩者的還原能力相差較大，VC的還原能力明顯強于PSE，但是當濃度超過200 μg/mL時，在濃度相同的條件下，兩者的還原能力差距變小，且隨后差距基本維持不變。這個結果與DPPH以及ABTS自由基的清除能力測定結果相同，進一步說明了測定結果的可靠性。

圖 3 PSE和VC的還原能力Fig.3 Reducing power of PSE and VC

2.3 對α-葡萄糖苷酶活力的抑制作用

由圖4可知，PSE和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的活性均有抑制作用，PSE的抑制能力（IC50值為（90.10±1.89） μg/mL），強于陽性對照阿卡波糖（IC50值為（453.60±4.02） μg/mL）兩者的降血糖能力具有顯著差異（P＜0.05）。另外，在實驗濃度范圍內，PSE和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度的增大而增大。

圖 4 PSE和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibition of PSE and acarbose on α-glucosidase activity

宋菲等[39]對新鮮檳榔的種子進行了酶活力抑制試驗，結果表明，檳榔籽提取物和陽性對照阿卡波糖的IC50值分別為（1.50±0.31）和（710±0.09） μg/mL。由此可見，雖然相對于未加工的新鮮檳榔籽來說，加工后的檳榔籽對α-葡萄糖苷酶的抑制作用有所減弱，但是仍然具有一定的抑制作用，有開發成為降血糖藥物的潛能。

3 討論

檳榔原果的主要成分為31.1%的酚類，18.7%的多糖，14.0%的脂肪，10.8%的粗纖維，9.9%的水分，3.0%的灰分和0.5%的生物堿[40]，檳榔中的多酚類物質主要是黃酮醇，包括10%的兒茶素，2.5%的表兒茶素和12%的無色花青素，其余的是不同聚合度的黃酮類化合物。檳榔經過加工其組分會發生不同程度的變化[41]。本次試驗研究結果表明，食用檳榔加工廢棄籽富含總多酚、總黃酮、原花青素等多種活性物質，其含量受提取材料、提取方法以及加工方式的影響，含有大量的黃酮類化合物，其中兒茶素的相對含量高達77.27%。經過初步檢測，PSE中各生物堿的含量為檳榔堿：（13.75±0.04） mg/g；檳榔次堿：（3.82±0.82） mg/g；去甲基檳榔堿：（4.82±0.07） mg/g；去甲基檳榔次堿：（3.98±0.10） mg/g。而檳榔生物堿是否對廢籽提取物的生物活性產生影響，是正面的還是負面的，需要體內試驗進一步研究。本試驗測定出檳榔廢棄籽具有一定的抗氧化能力，能夠對DPPH自由基和ABTS+自由基在一定程度上進行清除，對Fe3+具有一定的還原能力，而且還表明檳榔廢棄籽具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其對α-葡萄糖苷酶活力抑制的IC50值為（90.10±1.89） μg/mL，顯著（P＜0.05）強于陽性對照阿卡波糖，檳榔廢棄籽具有被開發為治療糖尿病藥物的潛力。綜上所述，對食用檳榔廢棄籽進行回收，進而再加工利用是十分必要的，且對環境保護有重要意義。然而對于檳榔廢棄籽的抗氧化和降血糖的具體機制還需要進一步探索。