超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮可溶性膳食纖維及其抗氧化活性分析

顏飛翔，朱立斌，朱 丹 ，苗欣月，牛廣財(cái), ，魏文毅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

糜子（Panicum miliaceumL.）又叫稷、黍和糜，屬禾本科黍?qū)伲秃登疑L(zhǎng)期短，在我國(guó)華北、東北和西北等地均有栽培[1-2]。糜子麩皮是糜子加工中的副產(chǎn)品，在加工制米之后，糜子麩皮基本屬于廢棄物，沒(méi)有得到充分利用，造成了資源浪費(fèi)。糜子麩皮中含有豐富的天然活性成分，如酚類(lèi)化合物[3]、膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素等。但是，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于糜子在食品方面的利用，主要通過(guò)與小麥粉等復(fù)配改善其加工特性，以及作為釀酒原料和地方小吃為主，相關(guān)產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用還不夠，尤其缺乏對(duì)糜子副產(chǎn)物的深入研究[4]。膳食纖維（Dietary fiber，DF）是食物中不被人體胃腸消化酶所分解、不可消化植物成分的總稱(chēng)，包括水溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（Insoluble dietary fiber，IDF）[5]。膳食纖維因具有預(yù)防肥胖癥[6]、心腦血管疾病[7]、改善腸道微環(huán)境[8]以及調(diào)節(jié)血糖及血脂水平[9-10]等諸多生理功能，成為了近年來(lái)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。而可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）含量的多少對(duì)于評(píng)價(jià)膳食纖維生理功能具有重要意義，因此，對(duì)膳食纖維中SDF的研究有助于進(jìn)一步探索膳食纖維的品質(zhì)及生理功能。

關(guān)于麩皮和果渣類(lèi)可溶性膳食纖維的提取方法，有酶法、化學(xué)法、發(fā)酵法、膜分離法及物理法等方法。其中，新發(fā)展出一些輔助的方法，如微波、超聲、加壓、超臨界等物理技術(shù)[11]，將多種方法協(xié)同使用是一種高效環(huán)保的提取方式，可以結(jié)合每種方法的優(yōu)點(diǎn)，在提高得率的同時(shí)保證其生物活性。其中，超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)日趨成熟，該技術(shù)充分利用微波的高能作用和超聲波的空化作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)有效成分在常壓下進(jìn)行充分提取[12]，在可溶性膳食纖維的提取方面得到了很好的應(yīng)用。例如，董玉瑋等[13]分別采用超聲法和超聲結(jié)合酶法對(duì)紅薯渣中SDF進(jìn)行提取，結(jié)果表明，超聲水提取紅薯渣中SDF提取率為5.64%；而采用超聲結(jié)合酶法提取最佳工藝條件為加酶量1.5%、料液比1:30（g/mL）、時(shí)間20 min、功率100 W，此時(shí)，紅薯渣中SDF提取率為7.29%，其對(duì)羥基和超氧自由清除率的IC50值分別為3.94和0.35 mg/mL。唐小閑等[14]采用超聲-微波輔助酶法對(duì)蓮藕中膳食纖維進(jìn)行提取，得到最佳工藝為：料液比 1:13（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、纖維素酶添加量0.6%、酶解溫度60 ℃，該條件下膳食纖維提取率為36.83%。吳俊男等[15]采用微波-酶法對(duì)小麥麩皮中可溶性膳食纖維進(jìn)行處理并測(cè)定其抗氧化活性，在微波功率280 W，微波時(shí)間90 s，酶添加量1.5%，酶解時(shí)間20 min的條件下處理的小麥麩皮SDF，其DPPH自由基清除率約為70%。由此可見(jiàn)，采用超聲、微波和酶法相結(jié)合的方法對(duì)膳食纖維進(jìn)行提取，是一種高效簡(jiǎn)潔的方法，且提取的樣品具有較好的生物活性。

目前，尚未有采用超聲-微波輔助酶法對(duì)糜子麩皮中可溶性膳食纖維進(jìn)行研究。本研究以糜子麩皮為原料，采用超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮可溶性膳食纖維，并且對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析，以期為糜子麩皮膳食纖維的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糜子麩皮 黑龍江省肇源縣產(chǎn)龍黍23品種，礱米后的副產(chǎn)物，其中總膳食纖維含量36.44%，蛋白含量10.1%，灰分含量15.4%；纖維素酶Celluclast 1.5L（酶活117.4 U/mL）、木聚糖酶shearzyme 500L（酶活500 FXU (S)/g）、高溫α淀粉酶Termamyl SC（酶活120 KNU/g）、堿性蛋白酶Alcalase 2.4FG（酶活2.4 AU/g） 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH） 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS） 上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、維生素C、過(guò)硫酸鉀、過(guò)氧化氫、無(wú)水碳酸鈉、硫酸亞鐵等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GY-FS-02多功能高速粉碎機(jī) 江西贛云食品機(jī)械有限公司；EX324電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；XH-300A型電腦微波超聲波合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；L420臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；ALPHA冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；RE 3000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海凌析達(dá)儀器；TECAN-sunrise酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；SX2-8-13NP馬弗爐上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合酶法提取糜子麩皮SDF

1.2.1.1 制備工藝 糜子麩皮經(jīng)粉碎，正己烷脫脂，采用1%的耐高溫α-淀粉酶，調(diào)節(jié)pH為6.5，在95 ℃反應(yīng)30 min脫除淀粉，采用2%堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為8.0，在50 ℃反應(yīng)30 min脫除蛋白，100 ℃沸水浴10 min滅酶，55 ℃烘干后，備用。固定液料比30:1 mL/g，復(fù)合酶（纖維素酶：木聚糖酶為1:1）添加量1.4%，調(diào)節(jié)酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、復(fù)合酶比例進(jìn)行酶解，結(jié)束后4000 r/min離心15 min收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/3；用4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉12 h；收集沉淀，冷凍干燥后，加適量水復(fù)溶后配成5%的溶液，4 ℃下蒸餾水透析（3500 Da）48 h，每8 h換一次水，冷凍干燥后，得到糜子麩皮可溶性膳食纖維。

1.2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以液料比為30:1 mL/g，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度55 ℃，酶解pH為5.0，復(fù)合酶添加量為1.4%，纖維素酶:木聚糖酶比例為1:1為固定條件，考察復(fù)合酶（纖維素酶:木聚糖酶）比例（2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2）、酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響。

1.2.2 超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮SDF

1.2.2.1 提取工藝 調(diào)節(jié)不同液料比、提取溫度、協(xié)同時(shí)間、超聲功率和微波功率進(jìn)行超聲-微波協(xié)同提取，在超聲波和微波的共同作用結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH為5.0，然后調(diào)節(jié)復(fù)合酶（纖維素酶:木聚糖酶為1:1）添加量，于55 ℃下酶解4 h。結(jié)束后4000 r/min離心15 min收集上清液，之后步驟同1.2.1.1制備工藝中的方法。

1.2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以液料比30:1 mL/g，超聲功率250 W，微波功率200 W，提取溫度50 ℃，復(fù)合酶添加量1.2%，協(xié)同時(shí)間20 min為固定條件，考察液料比（15:1、20:1、25:1、30:1、35:1 mL/g）、協(xié)同時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、提取溫度（40、45、50、55、60 ℃）、超聲功率（150、200、250 、300、350 W）、微波功率（100、200、300、400、500 W）、復(fù)合酶添加量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%）對(duì)糜子麩皮中SDF得率的影響。

1.2.3 超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮SDF響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以糜子麩皮SDF得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù) Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取A液料比、B協(xié)同時(shí)間、C提取溫度、D復(fù)合酶添加量4個(gè)因素，優(yōu)化超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮SDF的工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.2.4 計(jì)算方法 糜子麩皮SDF得率的計(jì)算，按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 糜子麩皮中總膳食纖維及灰分的測(cè)定 總膳食纖維的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》；灰分的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》。

1.2.6 糜子麩皮SDF中蛋白含量的測(cè)定 參照楊靜等[16]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定糜子麩皮SDF中蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=0.0057x+0.0207，R2=0.9979。

1.2.7 糜子麩皮SDF體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 采用李治龍等[17]的方法略有改動(dòng)。配制0.5 mmol/mL的DPPH溶液100 mL。取2 mL稀釋10倍后的樣液，加入0.5 mL的DPPH溶液，混合均勻后于37 ℃下避光20 min，用無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm條件下測(cè)定其吸光度Ai；用同體積的無(wú)水乙醇代替樣品溶液，測(cè)其吸光值為Ac，用同體積的無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，測(cè)其吸光值為Aj。按照（2）式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 參照宋藝君等[18]的方法，略有修改。分別配制50 mL的7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8溶液，之后將兩種溶液1:1混合后于室溫下暗處?kù)o置一夜，即得儲(chǔ)備液。然后用無(wú)水乙醇稀釋到其吸光值在0.7±0.2，得到ABTS工作液。取20 μL不同濃度的糜子麩皮SDF于試管中，加入2 mL的ABTS工作液，混勻，室溫下靜置10 min，用蒸餾水調(diào)零，在734 nm處測(cè)其吸光度值為Ai，用同體積的蒸餾水代替樣品，測(cè)定吸光值為A0。按照式（3）計(jì)算ABTS自由基清除率。

1.2.7.3 羥自由基清除率的測(cè)定 按照董佳萍等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。取0.1 mL樣品，加入2 mL 6 mmoL/L的過(guò)氧化氫溶液以及FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmoL/L的水楊酸溶液，搖勻，放置37 ℃恒溫水浴中1 h，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度A1。以去離子水為參比溶液，測(cè)定吸光度A0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測(cè)定吸光度A2。按式（4）計(jì)算羥自由基清除能力。

1.2.7.4 還原力的測(cè)定 按照程宏楨等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。精確吸取不同濃度2.0 mL的糜子麩皮SDF溶液，分別加入0.2 mo L/L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，振蕩混勻，50 ℃水浴30 min，之后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，然后在4000 r/min條件下離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液，振蕩混勻，以蒸餾水為參比，在在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶法提取糜子麩皮SDF單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶比例對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 由圖1可知，當(dāng)木聚糖酶添加量逐漸大于纖維素酶添加量時(shí)，SDF得率明顯升高，當(dāng)木聚糖酶：纖維素酶為1:1時(shí)，得率最大，而當(dāng)木聚糖酶比例超過(guò)纖維素酶時(shí)，又呈下降趨勢(shì)。這可能是由于兩種酶的作用機(jī)制的差異而導(dǎo)致的。由于纖維素酶可以把纖維素水解為半纖維素，而木聚糖酶則作用于半纖維素。因此，當(dāng)木聚糖酶量升高時(shí)，把更多的半纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性的，從而使SDF得率升高[21]，但當(dāng)木聚糖酶含量過(guò)高時(shí)，可溶性半纖維素降解為小分子低聚糖的速度超過(guò)了其生成速度，從而導(dǎo)致SDF得率下降[22]，因此選擇纖維素酶:木聚糖酶為1:1時(shí)最宜，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為2.60%。

2.1.2 酶解pH對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 從圖2中結(jié)果可知，SDF得率隨著pH的升高而不斷增加，在pH5.0時(shí)達(dá)到最高值2.74%，但pH大于5.0時(shí)，SDF得率逐漸減小。原因是酶與底物的結(jié)合受反應(yīng)體系pH值影響，先隨著pH的增大，逐漸達(dá)到酶的最適pH[23]，酶促反應(yīng)速率也達(dá)到最大值。超過(guò)其最適pH后，酶的活性降低，從而影響酶與底物的結(jié)合，使酶解反應(yīng)速率變慢，SDF得率隨之下降，因此pH 5.0是最適宜的酶解pH，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為2.74%。

圖 1 復(fù)合酶比例對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme ratio on SDF yield in millet bran

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 從圖3中結(jié)果可知，SDF得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，在4 h時(shí)達(dá)到最高值2.58%，但超過(guò)4 h時(shí)SDF得率逐漸降低。原因是SDF主要成分是果膠，而果膠中的原果膠是不溶于水的物質(zhì)，隨著延長(zhǎng)酶解時(shí)間，利于糜子麩皮中果膠質(zhì)充分酶解，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，果膠被分解成-1,4-D聚半乳糖醛酸，不能被乙醇沉淀出來(lái)[23-24]，從而其得率降低。因此確定最適酶解時(shí)間是4 h，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為2.58%。

圖 2 酶解pH對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis pH on SDF yield in millet bran

圖 3 酶解時(shí)間對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on SDF yield in millet bran

圖 4 酶解溫度對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on SDF yield in millet bran

2.1.4 酶解溫度對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 從圖4中結(jié)果可知，SDF得率先隨著溫度的升高而明顯增加，在溫度55 ℃時(shí)達(dá)到最大值2.55%，但溫度繼續(xù)升高，SDF得率逐漸下降。原因是適宜的溫度使纖維的結(jié)構(gòu)松散，暴露出更多的側(cè)鏈基團(tuán)，增大了底物與酶的接觸面積，促進(jìn)酶解反應(yīng)。溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)破壞SDF的主要成分果膠和β-葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)[25]，從而降低SDF得率。也可能由于溫度過(guò)高使酶的活性降低，反應(yīng)速率也會(huì)隨之減慢。因此確定最適酶解溫度為55 ℃，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為2.55%。

2.2 超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮SDF單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 由圖5中液料比的變化對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響可知，隨著液料比的增大，糜子麩皮SDF的得率也隨之增加，當(dāng)液料比為30:1 mL/g時(shí)，得率達(dá)到最大（6.02%）。這是因?yàn)樵谝欢舛确秶鷥?nèi)，溶劑可以有效地吸收微波，使物料適度膨脹，有利于增加接觸物料和溶劑之間的表面積，從而提高可溶性膳食纖維的溶出[26]。當(dāng)液料比高于30:1 mL/g時(shí)，得率開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)椋S著溶劑用量的持續(xù)增加，微波能對(duì)物料的作用力減弱，使得溶出的SDF開(kāi)始減少[27]。Ying等[28]研究認(rèn)為，可能是高比例的溶劑與溶質(zhì)比，延長(zhǎng)了溶質(zhì)向內(nèi)部組織的擴(kuò)散距離，致使SDF含量降低。因此，選擇液料比為30:1 mL/g，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為6.02%。

圖 5 液料比對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on SDF yield in millet bran

圖 6 協(xié)同時(shí)間對(duì)糜子麩皮中SDF得率的影響Fig.6 Effect of synergistic time on SDF yield in millet bran

2.2.2 協(xié)同時(shí)間對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 由圖6中協(xié)同時(shí)間對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響曲線(xiàn)可知，糜子麩皮SDF得率在20 min時(shí)候達(dá)到最大值6.17%，之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，則呈下降趨勢(shì)。超聲波增強(qiáng)傳質(zhì)的作用使SDF更容易釋放和擴(kuò)散到水中，同時(shí)在微波的作用下，糜子麩皮可以吸收微波的能量，熱量的積累進(jìn)一步促進(jìn)SDF溶解到溶液中，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致SDF降解，導(dǎo)致提取率降低[29]。因此，選擇協(xié)同時(shí)間為20 min，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為6.17%。

2.2.3 提取溫度對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 圖7反映了提取溫度對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響，隨著提取溫度的升高，糜子麩皮SDF得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，SDF在水中的溶解度增大，從而使 SDF得率增大。升溫導(dǎo)致SDF在水中的溶解度增大，但過(guò)高的溫度會(huì)使其發(fā)生降解，故當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，得率降低[30]。也有研究表明，可能是高溫和超聲的雙重作用導(dǎo)致SDF的結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而造成得率的下降[31]。因此，選擇提取溫度為50 ℃，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為5.73%。

圖 7 提取溫度對(duì)糜子麩皮中SDF得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on SDF yield in millet bran

2.2.4 超聲功率對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 由圖8可知，隨著超聲功率增加，膳食纖維提取率先快速升高后又快速降低。在超聲功率250 W時(shí)，膳食纖維提取率最大，為5.71%。主要是超聲波能在物料內(nèi)部產(chǎn)生振動(dòng)，超聲功率較小時(shí)對(duì)植物細(xì)胞和分子間的作用較小，超聲功率增大時(shí)，空化效應(yīng)更強(qiáng)烈[32]，膳食纖維的提取率增大，但功率過(guò)大時(shí)致使膳食纖維結(jié)構(gòu)破壞，提取率下降。由于超聲功率在250 W時(shí)已經(jīng)達(dá)到較高的得率，因此，選擇250 W為固定的超聲功率條件，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖 8 超聲功率對(duì)糜子麩皮中SDF得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic power on SDF yield in millet bran

2.2.5 微波功率對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響 由圖9可知，隨著微波功率的增加，糜子麩皮SDF的得率增加，當(dāng)微波功率為200 W時(shí)，得率為最高值6.04%，這可能是由于微波的熱效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，有利于SDF進(jìn)入溶劑中[26]，同時(shí)，纖維素、半纖維素等粗纖維成分被選擇性加熱，水解成低聚寡糖[33]，從而使糜子麩皮SDF增加，但是過(guò)高的微波功率會(huì)導(dǎo)致膳食纖維發(fā)生降解，從而導(dǎo)致產(chǎn)率降低。本實(shí)驗(yàn)中微波功率變化不大，因此，選擇200 W為微波固定的功率條件。

圖 9 微波功率對(duì)糜子麩皮中SDF得率的影響Fig.9 Effect of microwave power on SDF yield in millet bran

2.2.6 復(fù)合酶添加量對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響在圖10所示的復(fù)合酶添加量對(duì)糜子麩皮SDF得率的曲線(xiàn)中，隨著復(fù)合酶添加量的增加，糜子麩皮SDF得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酶促反應(yīng)中酶的濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致酶解不完全，從而使得可溶性膳食纖維含量較低[34]。在加酶量為1.4%時(shí)，可溶性膳食纖維得率最高，為5.47%。當(dāng)復(fù)合酶添加量低于1.4%的時(shí)候，復(fù)合酶能將不溶性膳食纖維轉(zhuǎn)化成可溶性膳食纖維。但當(dāng)酶的濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)使得部分膳食纖維被水解成不能被乙醇沉淀的低聚糖，反而降低其得率[13]。因此，選擇復(fù)合酶添加量為1.4%，此時(shí)糜子麩皮SDF得率為5.47%。

2.3 超聲-微波輔助酶法提取糜子麩皮SDF響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 按照選取的A液料比、B協(xié)同時(shí)間、C提取溫度、D復(fù)合酶添加量，進(jìn)行四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 回歸方程的建立及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，經(jīng)回歸擬合后得到二次回歸方程：Y=6.33+0.30A+0.24B+0.20C+0.096D-0.10AB-0.060AC-0.10AD-0.097BC+2.500E-003BD-0.048CD-0.66A2-0.75B2-0.73 C2-1.05 D2。

對(duì)模型方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，模型P＜0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)P=0.9988＞0.05，不顯著，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的二次回歸方程的結(jié)果可靠，可以對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)；決定系數(shù)R2=0.9999，校正系數(shù)RAdj2=0.9998，能夠解釋實(shí)驗(yàn)99.98%的響應(yīng)值變異，表明理論值與實(shí)際值擬合良好，可用于糜子麩皮SDF提取工藝的分析和優(yōu)化。由F值可知，各因素對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響大小順序?yàn)橐毫媳龋ˋ）＞協(xié)同時(shí)間（B）＞提取溫度（C）＞復(fù)合酶添加量（D）。

2.3.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面反映了當(dāng)液料比、協(xié)同時(shí)間、提取溫度以及復(fù)合酶添加量等四個(gè)因素的任意兩個(gè)變量取零點(diǎn)水平時(shí)，其他兩個(gè)因素的交互作用對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響。其相應(yīng)曲面坡度越陡峭，等高線(xiàn)越接近于橢圓形，說(shuō)明各因素之間交互作用越顯著[35]。

通過(guò)響應(yīng)面圖11，同時(shí)結(jié)合表3可知，在所有交互項(xiàng)中，除BD之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著之外，其它因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響均極顯著（P＜0.01）。其中，AD交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響最強(qiáng)，表明液料比和復(fù)合酶添加量對(duì)糜子麩皮SDF得率的影響最為明顯。隨著液料比和復(fù)合酶添加量的增加，糜子麩皮SDF得率先增加后減少，且液料比相應(yīng)曲面較陡，其影響程度大于復(fù)合酶添加量；當(dāng)液料比為30:1 mL/g，復(fù)合酶添加量為1.4%時(shí)，為臨界最佳參數(shù)；當(dāng)提取溫度和協(xié)同時(shí)間同時(shí)增加時(shí)，糜子麩皮SDF得率先增加后減少，協(xié)同時(shí)間曲面陡于提取溫度，表明協(xié)同時(shí)間比超聲功率影響大。因此，在實(shí)際操作中，應(yīng)充分考慮各因素的交互影響，慎重控制各因素的用量，以保證糜子麩皮SDF的得率。

圖 11 各因素對(duì)糜子麩皮SDF得率的交互作用Fig.11 Interaction of various factors on SDF yield of millet bran

圖 12 糜子麩皮SDF的體外抗氧化能力Fig.12 Anti-oxidant capacity of millet bran SDF from millet in vitro

2.3.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 由二次回歸方程預(yù)測(cè)糜子麩皮SDF的最佳提取條件為：液料比31:1 mL/g，協(xié)同時(shí)間21 min，提取溫度56 ℃，復(fù)合酶添加量1.4%，此條件下其SDF得率的理論預(yù)測(cè)值為6.39%。為驗(yàn)證上述結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，采用液料比31:1 mL/g，協(xié)同時(shí)間21 min，提取溫度56 ℃，復(fù)合酶（纖維素酶:木聚糖酶為1:1）的添加量1.4%，pH5.0，于55 ℃下酶解4 h。經(jīng)過(guò)3次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在上述條件下糜子麩皮SDF得率為6.35%±0.05%，與預(yù)測(cè)的理論值誤差較小。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，可以用該模型對(duì)糜子麩皮中SDF的得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。同時(shí)，對(duì)醇沉后的樣品進(jìn)行透析和冷凍干燥，計(jì)算得到樣品中所含的SDF含量為91.27%，純度較高。

2.4 糜子麩皮SDF體外清除自由基的能力

由圖12可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，糜子麩皮SDF抗氧化能力和濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，即隨著糜子麩皮SDF濃度的增大，其抗氧化效果也而逐步增強(qiáng)，特別是對(duì)于DPPH自由基和羥自由基有較好的清除能力。當(dāng)糜子麩皮SDF樣品質(zhì)量濃度達(dá)14 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率為83.65%，低于1 mg/mL的VC清除率（95.40%），通過(guò)SPSS25.0分析，其IC50值為2.45 mg/mL。對(duì)于羥自由基清除能力來(lái)說(shuō)，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度小于6 mg/mL時(shí)，其清除能力隨樣品濃度升高而明顯加強(qiáng)；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)14 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基清除率達(dá)到最大，為81.48%，低于1 mg/mL的VC清除率（92.97%），其IC50值為5.98 mg/mL。糜子麩皮SDF的還原力以及對(duì)于ABTS+自由基的清除能力較弱，當(dāng)樣品濃度達(dá)14 mg/mL時(shí)，其還原力和對(duì)于ABTS+自由基的清除率分別為1.219和31.29%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1 mg/mL的Vc抗氧化能力（1.422和94.12%），ABTS+自由基的IC50值為26.15 mg/mL。由此可以看出，糜子麩皮SDF對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

將超聲-微波輔助酶法應(yīng)用到糜子麩皮可溶性膳食纖維的提取中，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得出其最佳提取工藝條件為：液料比為31:1 mL/g、協(xié)同時(shí)間21 min、提取溫度56 ℃、復(fù)合酶添加量1.4%，該條件下糜子麩皮SDF得率為6.35%。抗氧化活性表明，當(dāng)樣品濃度為14 mg/mL時(shí)，糜子麩皮SDF的還原力為1.219，其對(duì)于DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和羥自由基清除率的IC50值分別為2.45、26.15和5.98 mg/mL，說(shuō)明糜子麩皮SDF有一定的抗氧化活性。該研究結(jié)果為糜子麩皮可溶性膳食纖維的提取提供依據(jù)，為后續(xù)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。